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Characterization of Nucleoporin 98-fusion proteins
Theresa Humer
Florian Grebien
Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020
Leukemia is a heterogeneous hematopoietic disorder. Acute myeloid leukemia (AML) is a particularly aggressive and common type of this cancer that affects the myeloid compartment of the hematopoietic system. Up to 2 % of AML cases are caused by Nucleoporin 98 (NUP98)- fusion proteins and affected cases are associated with particularly poor prognosis. More than 25 distinct chromosomal translocations involving the NUP98 gene have been described. All NUP98-fusion proteins share the N-terminal part of endogenous NUP98, which consists of two intrinsically disordered regions harboring phenylalanine-glycine (FG)-repeats. Intrinsically disordered regions are highly flexible protein modules that lack a defined secondary structure. Furthermore, intrinsically disordered region-containing proteins have a higher tendency to form membraneless organelles through biomolecular condensation. The N-terminal part of NUP98 is linked to the C-terminal part of several fusion partner genes, of which most have functions in epigenetic regulation and gene expression. The aim of this thesis was the investigation of the subcellular localization of NUP98-fusion proteins and their potential involvement in biomolecular condensates. Using IF and confocal microscopy we found that five structurally distinct NUP98-fusion proteins do not co-localize with the nuclear envelope but showed their capability of forming biomolecular condensates within the nucleus. In further experiments, three different GFP-tagged artificial IDR-containing fusion proteins were designed on the basis of NUP98-KDM5A. This artificial N-terminal part contained either FG, tyrosine-glycine (YG) or alanine-alanine (AA)-repeats. The influence of the N-terminal part and their ability to form biomolecular condensates was analyzed via live cell imaging. The artificial AA-KDM5A fusion protein showed a homogeneous signal within the nucleus, whereas artificial YG-KDM5A and artificial FG-KDM5A fusions were expressed in speckled patterns consistent with biomolecular condensation. RNA sequencing of fetal liver cells expressing the artificial fusion proteins showed overlapping gene expression profiles induced by NUP98-KDM5A and the artificial FG-KDM5A fusion, which were not shared by cells expressing the artificial AA-KDM5A, or artificial YG-KDM5A fusions, supporting the conclusion that artificial FG-KDM5A is capable of inducing the leukemia-specific gene expression pattern of NUP98-KDM5A. This work deepens our knowledge of NUP98-fusion proteins and their involvement in phase separation and the dependency of FG-repeats in NUP98-fusion protein-driven AML.
Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020
Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine besonders aggressive und häufige Krebsart, die das myeloische Kompartiment des hämatopoetischen Systems betrifft. Bis zu 2% der AML- Fälle werden durch Nucleoporin 98 (NUP98)-Fusionsproteine verursacht. Betroffene Fälle gehen mit einer schlechten Prognose einher und enden unbehandelt tödlich. Es wurden mehr als 25 verschiedene chromosomale Translokationen mit Beteiligung des NUP98-Gens beschrieben. Alle NUP98-Fusionsproteine beinhalten den N-terminalen Teil des endogenen NUP98, der aus zwei ungeordneten Regionen (IDRs) besteht, die Phenylalanin-Glyzin (FG)- Aminosäurewiederholungen enthalten. IDRs sind hochflexible Proteinmodule, denen eine definierte Sekundärstruktur fehlt. Darüber hinaus neigen IDRs-enthaltende Proteine stärker dazu, durch biomolekulare Kondensation membranlose Organellen zu bilden. Der N- terminale Teil von NUP98 ist mit dem C-terminalen Teil mehrerer Fusionspartnergenen verbunden, von denen die meisten Funktionen in der epigenetischen Regulation und der Genexpression übernehmen. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der subzellulären Lokalisation von NUP98-Fusionsproteinen und ihrer möglichen Beteiligung an biomolekularen Kondensaten. Unter Verwendung von Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie fanden wir, dass fünf strukturell unterschiedliche NUP98-Fusionsproteine nicht mit der Kernhülle kolokalisieren, sondern ihre Fähigkeit zur Bildung von biomolekularen Kondensaten im Kern zeigen. In weiteren Experimenten wurden drei verschiedene GFP- markierte künstliche IDR-enthaltenden Fusionsproteine auf der Basis von NUP98-KDM5A entworfen. Dieser künstliche N-terminale Teil enthielt entweder FG-, Tyrosin-Glyzin (YG)- oder Alanin-Alanin (AA)-Aminosäurewiederholungen. Der Einfluss des N-terminalen Teils und dessen Fähigkeit zur Bildung von biomolekularen Kondensaten wurde mittels Lebendzellmikroskopie analysiert. Das AA-KDM5A-Fusionsprotein zeigte ein homogenes Signal im Kern, während YG-KDM5A- und FG-KDM5A-Fusionen gesprenkeltes Muster aufwiesen, die charakteristisch für biomolekulare Kondensation sind. RNA- Sequenzierungsexperiments von fötalen Leberzellen, welche die künstliche Fusionsproteine exprimierten, zeigten überlappende Genexpressionsprofile, die durch NUP98-KDM5A und die FG-KDM5A-Fusion induziert wurden. Jedoch wurde dieses Genexpressionsmuster nicht von Zellen geteilt, die AA-KDM5A oder YG-KDM5A-Fusionen exprimierten. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass FG-KDM5A in der Lage ist, Leukämie-spezifische Genexpressionsmuster von NUP98-KDM5A hervorzurufen. Diese Arbeit vertieft unser Wissen über NUP98-Fusionsproteine hinsichtlich der Beteiligung der biomolekularen Kondensatbildung und der Abhängigkeit von FG-Wiederholungen bei NUP98- Fusionsprotein-gesteuerter AML.
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2020
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