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The role of STAT5B in megakaryocyte differentiation
Gabriela Julia Feurstein
Heid Neubauer-Sedy
Sibylle Kneissl
Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2022
The hematopoietic system relies on cytokine signaling to mediate differentiation, proliferation and survival of the various blood cells. One of these cytokines is thrombopoietin (TPO) that is responsible for the differentiation of megakaryocytes (Mks), the producers of platelets. TPO signals through the Janus kinase 2 (JAK2) - signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) pathway. Once TPO binds to the thrombopoietin receptor, the receptor associated JAKs trans-phosphorylate one another which leads to the subsequent recruitment and phosphorylation of STAT5. STAT5 then translocates to the nucleus where it acts as a transcription factor and activates the expression of its target genes. STAT5 comprises two different gene products, STAT5A and STAT5B, and although it has been shown that TPO signaling primarily activates STAT5B, it is not known if STAT5A and STAT5B are differentially involved in megakaryopoiesis. To start addressing this question, our group investigated the myeloid lineage of a transgenic mouse model expressing 1.5-fold higher levels of STAT5B in the hematopoietic compartment. This moderate increase in expression of STAT5B already had an impact on the expansion of mature megakaryocytes but only in female mice. This led us to hypothesize that STAT5B plays a role in megakaryocyte differentiation in a sex-specific way. The aim of my project was to further dissect the differential roles of STAT5A and STAT5B as well as the effect of estrogen, the primary female sex hormone, on megakaryopoiesis. For this, I used a murine hematopoietic stem cell line with altered STAT5 expression levels to perform megakaryocyte differentiation assays. Mk differentiation was assessed by quantification of the megakaryocyte progenitors using flow cytometry. The ploidy, a characteristic feature of mature megakaryocytes, was analyzed using propidium iodide staining. The mature megakaryocytes were also visualized by cytospin. We observed that the cells with increased STAT5B levels differentiated more strongly towards Mks than the ones with increased STAT5A levels or only expressing the empty vector. This confirms what we previously observed in the transgenic mouse model. Estrogen, which was used to investigate the sex-specific differences observed in the mouse model, had no effect on megakaryocyte differentiation in this setting. To validate this lack of effect, further experiments in different models will be needed. To summarize, I was able to show that STAT5B has a more prominent role over STAT5A in regulating Mk differentiation in the cell line model.
Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2022
Das hämatopoetische System beruht auf Zytokinsignalen, um die Differenzierung, Proliferation und das Überleben der verschiedenen Blutzellen zu ermöglichen. Eines dieser Zytokine ist Thrombopoietin (TPO), das für die Differenzierung von Megakaryozyten (Mks), den Produzenten von Blutplättchen verantwortlich ist, nimmt Einfluss auf den JAK2-STAT5 Signalweg. Sobald TPO an den Thrombopoietinrezeptor bindet, transphosphorylieren die Rezeptor assoziierten JAKs einander, was zur anschließenden Rekrutierung und Phosphorylierung von STAT5 führt. STAT5 wandert dann in den Zellkern, wo es als Transkriptionsfaktor fungiert und die Expression seiner Zielgene aktiviert. STAT5 umfasst zwei verschiedene Genprodukte, STAT5A und STAT5B, und obwohl gezeigt wurde, dass die TPOSignalgebung hauptsächlich STAT5B aktiviert, ist nicht bekannt, ob sie unterschiedlich an der Megakaryopoese beteiligt sind. Um diese Frage zu beantworten, untersuchte unsere Gruppe die myeloische Abstammung eines transgenen Mausmodells, das ein 1,5-fach höheres STAT5B level im hämatopoetischen Kompartiment exprimiert. Dieser moderate Anstieg der Expression von STAT5B hatte bereits Auswirkungen auf die Expansion reifer Megakaryozyten, jedoch nur bei weiblichen Mäusen. Dies veranlasste uns zu der Hypothese, dass STAT5B auf geschlechtsspezifische Weise eine Rolle bei der Differenzierung von Megakaryozyten spielt. Das Ziel meines Projekts war es, die unterschiedlichen Rollen von STAT5A und STAT5B sowie die Wirkung von Östrogen, dem primären weiblichen Sexualhormon, auf die Megakaryopoese weiter zu analysieren. Dazu habe ich eine murine hämatopoetische Stammzelllinie mit verändertem STAT5-Expressionsniveau verwendet, um Megakaryozyten- Differenzierungsassays durchzuführen. Die Mk Differenzierung wurde durch Quantifizierung der Megakaryozyten Vorläufer mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Die Ploidie, ein charakteristisches Merkmal reifer Megakaryozyten, wurde unter Verwendung von Propidiumiodid Färbung analysiert. Die reifen Megakaryozyten wurden auch durch Cytospin sichtbar gemacht. Wir beobachteten, dass die Zellen mit erhöhten STAT5B stärker in Richtung Mks differenzierten als die mit erhöhtem STAT5A Level. Dies bestätigt, was wir zuvor im transgenen Mausmodell beobachtet haben. Östrogen, das verwendet wurde, um die im Mausmodell beobachteten geschlechtsspezifischen Unterschiede zu untersuchen, hatte in diesen Zellen keine Wirkung auf die Differenzierung von Megakaryozyten. Um diesen fehlenden Effekt zu validieren, sind weitere Experimente in verschiedenen Modellen erforderlich. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass STAT5B eine wichtigere Rolle als STAT5A bei der Regulierung der Mk-Differenzierung im Zelllinienmodell spielt.
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2022
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