Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021

Osteoarthrose (OA) ist eine beim alternden Pferd weit verbreitete Erkrankung. 50 % aller Pferde über 15 Jahre (van Weeren und Grauw 2010) sind weltweit davon betroffen, unabhängig ob Freizeitpferd oder Sportpferd. OA ist eine klassische Verschleißerkrankung, die durch unterschiedliche intrinsische und extrinsische Einflussfaktoren, wie z.B. Trauma, Überlastung und Entzündungen entstehen und gefördert werden kann. Dabei gehen die Chondrozyten in Seneszenz über und es kommt zum Abbau von Knorpelmatrix, was Knorpeldefekte zurücklässt. Bei Seneszenz verlieren die Chondrozyten ihre Teilungsfähigkeit aufgrund von verkürzten Telomeren und verändern ihre mitotische Aktivität hin zur Ausbildung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotypes. In Folge dieser Veränderungen kommt es zum Verlust des gesunden Knorpelgewebes, Ausbreitung der OA auf den gesamten Gelenkknorpelbereich und es treten Bewegungsschmerzen, Einschränkungen im Bewegungsradius, Weichteilschmerzen und röntgenologische Veränderungen auf. Aufgrund der sehr schlechten intrinsischen Regenerationskapazität des Knorpels ist eine Restitutio ad integrum nicht möglich. Statt physiologischen Kollagen Typ 2 wird minderwertiges Kollagen Typ 1 gebildet. Es entsteht biomechanisch weniger belastbarer Faserknorpel, der anfälliger für erneute Verletzungen ist. Die derzeitigen Therapiemöglichkeiten sind dahingehend sehr beschränkt und bestehen vor allem aus anti-inflammatorischen und chondroprotektiven Regimen, wie Hyaluron oder Polysulfatierte Glycosaminoglykane. So kann die Entzündungsphase verkürzt werden und im besten Fall das Voranschreiten verlangsamt werden. Trotzdem kann eine Bildung von Kollagen Typ 1 nicht verhindert werden. Nach Studien von Conboy et al. (Carlson und Conboy 2007, Conboy et al. 2005, Conboy und Rando 2012) in denen beschrieben wurde, dass durch ein fetales Milieu Entzündungsgeschehen reduziert werden können und alte Gewebe eine bessere Heilung zeigten, ist die Fragestellung dieser Diplomarbeit gesetzt worden, ob fetales Kälberserum (FCS) eine Verjüngung von Chondrozyten bewirken kann. Durch Imitierung eines fetalen Milieus in vitro sollen die Zellen zur Hochregulation von reparaturspezifischen Molekülsignalen angeregt werden und die Regenerationskapazität erhöht werden. Möglicherweise können so auch seneszente Zellen zurück in den Zellzyklus gelangen und osteoarthrotische Veränderungen minimiert werden. Ziel dieser Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob adulte, potenziell osteoarthrotisch-veränderte Chondrozyten durch die Kultivierung mit FCS im Vergleich zur Kultivierung ohne FCS und im Vergleich zu nativem Knorpelgewebe eine Verjüngung erfahren, im Sinne der Genexpression und ob FCS in der Kultur die negativen Einflüsse entstehend durch Kultivierung, Veränderungen im Sauerstoffpartialdruck und Digestationsenzyme, ausgleichen kann. Hierfür wurden Knorpelproben von sechs Pferden mit einem Alter von über 15 Jahre von den Femurkondylen gewonnen. Die Einteilung der Proben erfolgte in drei Gruppen: nativer Knorpel, isolierte Chondrozyten in Zellkultur mit FCS und isolierte Chondrozyten in Zellkultur ohne FCS. Nach Kultivierung bzw. direkt nach der Probenentnahme (nativer Knorpel) wurde die RNS isoliert und von dem externen Labor tamiRNA mittels Next Generation Sequencing analysiert. Der Fokus lag dabei auf OA-spezifischen, Seneszenz-assoziierten und Hypertrophie Genen, um den Einfluss von FCS im Kulturmedium zu untersuchen. Im Ergebnis lässt die Genanalyse keine eindeutige Aussage zur Beantwortung der Fragestellung zu. Ursächlich für dieses uneindeutige Ergebnis kann die zu geringe Probenanzahl sein, sodass die Varianz der einzelnen Gen-Expressions-Werte die Ergebnisse zu stark beeinflusst. Ebenso können die Inhaltsstoffe der Chargen von FCS und dem genutzten STEM MACS die Ergebnisse beeinflussen. Die Unterschiede in der Zusammensetzung und Konzentration, speziell der Eicosanoide im FCS kann das Milieu der Chondrozyten pro-inflammatorisch beeinflussen. Um eine bessere Aussage treffen zu können, sollte der Versuch mit mehr Proben wiederholt werden. Auch könnte das Alter der Pferde höher angesetzt werden, um wirklich osteoarthrotisch veränderte Knorpelproben zu gewinnen bzw. mit Proben von bekanntlich osteoarthrotisch veränderten Gelenken gearbeitet werden. So könnte man sicher sein, dass Osteoarthritis und Seneszenz bei allen Proben vorliegt.

Osteoarthritis (OA) is a common condition in the aging horse. It affects 50% of all horses over 15 years of age worldwide (van Weeren and Grauw 2010), whether leisure or sport horses. OA is a classic wear and tear disease that can develop and be promoted by various intrinsic and extrinsic contributing factors, such as trauma, overload, and inflammation. In this process, chondrocytes enter senescence and cartilage matrix degradation occurs, leaving cartilage defects. In senescence, chondrocytes lose their ability to divide due to shortened telomeres and change their mitotic activity toward the formation of the senescence-associated secretory phenotype. As a result of these changes, there is loss of healthy cartilage tissue, spread of OA to the entire articular cartilage area, and there is pain on movement, limitation of range of motion, soft tissue pain, and radiographic changes. Due to the very poor intrinsic regenerative capacity of cartilage, restitutio ad integrum is not possible. Instead of physiological type 2 collagen, inferior type 1 collagen is formed. The result is biomechanically less resilient fibrocartilage that is more susceptible to re-injury. Current therapeutic options are very limited in this regard and consist mainly of anti-inflammatory and chondroprotective regimens, such as hyaluronan or polysulfated glycosaminoglycans. Thus, the inflammatory phase can be shortened and, in the best case, the progression slowed down. Nevertheless, type 1 collagen formation cannot be prevented. Following studies by Conboy et al. (Carlson and Conboy 2007, Conboy et al. 2005, Conboy and Rando 2012) in which it was described that a fetal milieu can reduce inflammatory events and old tissues showed better healing, the question of this thesis has been set whether fetal calf serum (FCS) can induce a rejuvenation of chondrocytes. By mimicking a fetal environment in vitro, the cells should be stimulated to upregulate repair-specific molecular signals and increase regenerative capacity. It may also allow senescent cells to return to the cell cycle and minimize osteoarthritic changes. The aim of this work was to answer the question whether adult, potentially osteoarthritically altered chondrocytes undergo a rejuvenation by cultivation with FCS compared to cultivation without FCS and compared to native cartilage tissue, in terms of gene expression and whether FCS in culture can compensate for the negative influences arising from cultivation, changes in oxygen partial pressure and digestion enzymes. For this purpose, cartilage samples were obtained from the femoral condyles of six horses older than 15 years. The samples were divided into three groups: native cartilage, isolated chondrocytes in cell culture with FCS, and isolated chondrocytes in cell culture without FCS. After cultivation or directly after sample collection (native cartilage), RNA was isolated and analyzed by the external laboratory tamiRNA using next generation sequencing. The focus was on OA-specific, senescence-associated and hypertrophy genes to investigate the influence of FCS in the culture medium. As a result, the gene analysis does not allow a clear conclusion to answer the question. The reason for this ambiguous result may be the too small number of samples, so that the variance of the individual gene expression values influences the results too much. Likewise, the ingredients of the batches of FCS and the STEM MACS used may influence the results. The differences in composition and concentration, especially of eicosanoids in FCS may influence the chondrocyte pro inflammatory milieu. Also, the age of the horses could be set higher to obtain truly osteoarthritically altered cartilage samples or work with samples from known osteoarthritically altered joints. This way, one could be sure that osteoarthritis and senescence are present in all samples.

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135 Blätter