Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2021

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021

Chamomile (Matricaria chamomilla) is an important and frequently used medicinal plant in Traditional European Medicine (TEM). Its pharmaceutical value has been proven through years of scientific research. It has been indicated that M. chamomilla possesses many health benefits, including analgesic, anti-allergic, antispasmodic, antibacterial, anti-inflammatory and sedative properties. Additionally, attention for research work has been paid to the flavonoid compounds in the extracts. Especially flavones and flavonols have been found to be spasmolytic and anti-phlogistic as well as to have antioxidant activities. Even though chamomile is a widespread used medicinal plant and its flavones are being investigated, there is actually no information on proteins expressed in the plant or their interactions with flavonoids. The aim of this study was to find an appropriate protein extraction method for Matricaria chamomilla flower tissue. In order to determine, whether the protein extraction method was successful, the protein extracts were analysed by SDS-PAGE. Pharmaceutical-grade dried chamomile blossoms were ground into fine powder in a mortar by adding liquid nitrogen. Pre-prepared dry extract was tested along the fresh material. Different extraction strategies were applied including addition of distilled water ( 25°C), water ( 100°C), 50 % methanol:water, 100 % methanol, urea and SDS buffer to the ground chamomile powder. After filtration, the protein concentration of extracts was measured. Since the concentration of extracted protein was extremely low, various precipitation methods were applied in order to enrich the proteins. In a first approach trichloroacetic acid and acetone solution (20 %) were added directly to ground chamomile powder. In a second method, SDS solution (12 %) was used in combination with trichloroacetic acid and acetone. The third method used a methanol/chloroform precipitation. Additionally, ultrafiltration was performed in order to enhance protein concentration in solution and to eliminate the interfering yellow colour. Finally, the samples were air dried, solved in lysis buffer and analysed by SDS-PAGE and silver staining. The direct precipitation with 20% trichloroacetic acid and acetone has been shown to be the most effective method for extraction of proteins. The SDS-PAGE gels showed the clearest bands, less smearing along the lanes and good reproducibility. However, further experiments are needed to improve the direct precipitation method.

Die Kamille (Matricaria chamomilla) ist eine sehr wichtige und häufig verwendete Heilpflanze in der Traditionellen Europäischen Medizin, deren pharmazeutischer Wert als Heilpflanze durch Jahre an wissenschaftlicher Forschung bestätigt wurde. M. chamomilla werden viele gesundheitliche Nutzen zu geschrieben, besonders schmerzlindernde, anti-allergische, krampflösende, antibakterielle, entzündungslindernde und beruhigende Eigenschaften. Der Fokus der wissenschaftlichen Arbeit über M.chamomilla in den letzten Jahren lag besonders bei der Erforschung der enthaltenen Flavonoide und deren Glykoside. Diesen werden auch die vorherig erwähnten pharmazeutischen Wirkungen zugesprochen. Obwohl die Kamille eine weltweit verbreitete Pflanze ist und deren Flavonoide intensiv untersucht werden, gibt es keine Informationen über die Proteine oder über Interaktion von Proteinen und Flavonoid in der Kamille. Das Ziel dieser Studie war es eine geeignete Methode zur Proteinextraktion aus M. chamomilla zu finden. Um zu bewerten, ob die Extraktionsmethoden erfolgreich waren, wurden die Extrakte mittels SDS-PAGE analysiert. Die, in einer Apotheke erhaltenen, getrockneten Kamillenblüten wurden in einen feinen Puder mithilfe von einem Mörser und Stößel unter Zugabe von flüssigem Stickstoff gerieben. Kommerziell erhaltbarer Kamilletrockenextrakt wurde ebenfalls untersucht. Die unterschiedlichen Extraktionsmethoden wurden durch Zugabe von Wasser (25 °C), Wasser (100 °C), Methanol (50 %), Methanol (100 %), Urea (8 M) und SDS (0,4 %) durchgeführt. Nach der Filtration wurden die Proteinkonzentrationen gemessen. Aufgrund zu geringer Konzentration, wurden mehrere Präzipitationsmethoden getestet, um die Proteine anzureichern. Die erste Methode beinhaltete das direkte Hinzufügen von einer 20%igen TCA/Acetone-Lösung zu geriebenem Kamillenblütenpulver. Die zweite Methode war eine leichte Modifikation der ersten, bei der Kamillenblütenpulver vor der 20% TCA/Acetone Fällung mit SDS behandelt wurde. Bei der dritten Methode wurde eine Methanol/Chloroform Präzipitation angewendet. Eine weitere Methode basierend auf Ultrafiltration, wurde verwendet um die Proteinkonzentration zu erhöhen und gleichzeitig Flavonoide zu trennen. Die Proben wurden nach der Fällung in Lysispuffer gelöst und mit SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Silberfärbung sichtbar gemacht. Dabei hat sich gezeigt, dass die TCA/Acetone Präzipitation am besten geeignet war für die Proteinextraktion aus Kamillenblüten. Die SDS-PAGE Gele dieser Methode haben die klarsten Banden sowie den geringsten Schmiereffekt gezeigt und die Methode hatte eine gute Reproduzierbarkeit. Es sind jedoch noch weitere Experimente und Verbesserung notwendig, um Proteine aus Kamillenblüten genauer zu untersuchen.

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