Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2021

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021

Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation (SP3) is a novel protein digestion method based on paramagnetic beads, claiming to be able to outperform other methods. In this thesis SP3 was compared to in-solution digestion and FASP. Yeast proteins were digested using a combination of Trypsin and LysC with the different protocols. Then the peptides were purified with C18 columns before analysis by nano HPLC coupled to an Orbitrap mass spectrometer. To compare the different protocols, protein IDs were chosen as an important parameter, but also other parameters like the protein abundances of the technical and LC-MS replicates were taken into consideration. Although being described as a superior protocol, especially in sub-microgram analyses. In this study however, SP3 did not show the appropriate performance compared to in-solution digestion protocol. Therefore, different parameters and steps of the sample preparation were investigated in detail. First, the influence of the storage time of bead mixture was tested (fresh, 7 and 14 days old). Storage of beads for 14 days prior to use did not show any strong influence on the number of identified proteins. Furthermore, the loading conditions were modified: higher bead amount; increase of incubation time on the magnetic rack; variation of the number of washing steps as well as reloading the flow-through on fresh magnetic beads in order to minimise the protein loss during the sample loading step. Omitting the washing step under loading conditions and using higher bead concentration, not only enabled reproducible numbers of protein IDs and enhanced the protein output but also reduced sample handling resulting in faster preparation. Despite improved protein identifications, protein loss still was higher than with in-solution digestion. Further prospects would be changing the protein binding conditions by using different solvents like ethanol. This thesis led to the conclusion, that SP3 still may have advantages for example when handling samples containing detergents and dealing with low available protein amounts but still the protocol needs further improvement.

SP3 ist eine neue Proteinverdaumethode basierend auf der Wirkung paramagnetischer Kügelchen, diese soll vergleichbare Methoden übertreffen können. In dieser Arbeit wurde Hefeextrakt mit einer Enzymmischung aus Trypsin und LysC verdaut und dabei SP3 mit dem Verdau in Lösung und bzw. Ultrafiltrationseinheiten vergleichen. Als Parameter für die Effizienz der Probenaufarbeitung und des Proteinverdaus wurden die Zahlen der Proteinidentifizierungen und die Proteinabundanz der Proben verwendet. Obwohl SP3 als überlegenes Protokoll, speziell im Sub-Mikrogrammbereich, beschrieben wird, zeigen die Ergebnisse, dass SP3 durch Verdau in Lösung und mit Ultrafiltrationseinheiten übertroffen wurde. Hierbei wurden unterschiedliche Schritte des Originalprotokolls zur Probenaufarbeitung modifiziert und analysiert. Als erster Schritt wurde die Haltbarkeit der Kügelchen in Lösung überprüft, indem derselbe Versuch mit Kügelchen aus derselben Lösung an drei unterschiedlichen Tagen durchgeführt wurde (frisch, nach 7 und 14 Tagen). Das Lagern der Kügelchen hatte keinen Einfluss auf die Leistung der Kügelchen beim Proteinverdau. Zusätzlich wurden die Beladungsbedingungen der Proteine auf die Kügelchen verändert, indem eine größere Menge an Kügelchen verwendet wurde. Um eine bessere Bindung an den Magneten zu ermöglichen, wurde die Anzahl der Wasch- und Reinigungsschritte modifiziert. Außerdem wurden die Proteine des Überstands nach dem Bindungsschritt auf frische Kügelchen geladen. Das Auslassen des ersten Waschschritts mit dem Bindungsmedium und die Erhöhung der Menge an Kügelchen haben die zu erwartenden Ergebnisse gebracht. Die Wiederholbarkeit Anzahl der Identifizierungen konnten verbessert werden und die Arbeitsschritte haben sich verringert, was die Praktikabilität und Arbeitszeit des Protokolls verbessert hat. Obwohl eine Steigerung der Effizienz zu beobachten war, erreicht auch das modifizierte Protokoll nicht die Leistungen des Verdaus in Lösung. Das führt zu dem Schluss, dass SP3 zwar Vorteile wie die Eliminierung von unerwünschten Bestandteilen und der niedrigen benötigten Proteinmenge mit sich bringt, jedoch immer noch Verbesserung nötig sind.

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