Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020

In the last decade, research on the phytocannabinoid CBD has intensified. CBD originates from the plant Cannabis sativa and seems to have promising therapeutic efficacy on neurological disorders, inflammation and epilepsy. It is even considered to provide a new way of targeting cancer cells. Therefore, CBD is being discussed as a potential anti-cancer drug, while the effects of CBD have not yet been fully understood. It is known that cancer cells shift their metabolism from oxidative phosphorylation towards glycolysis, referred to as the Warburg effect. 2-DG, a structural analog of glucose, is proposed to act anti-cancerogenic in a combinatory therapy but to prove this, further studies are required. Based on previous studies from the Neurochemistry Group on neuroblastoma cells, we performed experiments to assess the cytotoxicity of a concomitant treatment of CBD and 2- DG in mesencephalic primary cells. Furthermore, possible benefits of a ketogenic diet in vitro were studied in this culture model. Furthermore, in a second part of the thesis, it was tried to establish an in vitro model for ketogenic diet, which likewise is discussed to be beneficial in some kinds of cancer. A ketogenic diet is a diet very low in carbohydrates with a moderate-protein and a high fat intake. Thus, it directly targets glycolysis by partially blocking it. Moreover, some cancer types are not able to adapt their metabolism and cannot use ketone bodies as an alternative source of energy. The consequence for these cancers might be starvation of energy while normal cells adapt and compensate the missing glucose with ketone bodies such as BHB. Therefore, mesencephalic primary cells were incubated for a week with a glucose and glutamine deprived medium substituted with BHB. Various biochemical analyses were performed to measure the effects of the experiments on the cells: To assess overall metabolism, resazurin reduction and ATP assays were conducted. To measure the amount of living cells, a BCA protein assay was used. The amount of dead cells was determined by LDH activity measurements. For analyzing the effects of a ketogenic diet, additionally JC-1 and Hoechst 33342/propidium iodide fluorimetry was used. TH immunocytochemistry staining was performed to detect the dopaminergic neurons represented in the culture. The study has revealed that partial inhibition of glycolysis using 2-DG has a similar effect on both, neuroblastoma cells and mesencephalic primary cells. Results have shown that the effect of CBD at a concentration of 10 μM is cytotoxic. CBD and 2-DG in combination had minimal additive cytotoxic effect on both cell cultures. Therefore, our data do not support the hypothesis that CBD and 2-DG might serve as an anti-cancer treatment. Since the anti-cancer effects of CBD and 2-DG are low and the negative effects on primary cells are comparatively high, further animal experiments with the same treatment cannot be recommended, but it must be noted that in vitro experiments cannot represent the in vivo situation completely. With our second model we developed a model that simulates a ketogenic diet in vitro. Our data have revealed that mesencephalic primary cells can not compensate the lack of glucose with the provided BHB. It will take further studies to confirm this finding.

Im letzten Jahrzehnt beschäftigte sich die Forschung intensiv mit dem Phytocannabinoid CBD. CBD, ein aus der Pflanze Cannabis sativa isolierbarer Wirkstoff, scheint eine viel- versprechende Wirkung bei der Therapie von neurologischen Störungen, Entzündungen, Suchtverhalten und Epilepsie zu haben. Weiters wird untersucht, ob mit CBD auch Krebszellen behandelt werden können, in der Hoffnung, mit CBD neue Krebsmedikamente entwickeln zu können. Der Warburg-Effekt beschreibt, dass Krebszellen ihren Metabolismus von oxidativer Phosphorylierung primär auf Glykolyse umstellen. 2-DG, ein strukturelles Analogon der Glucose, hemmt die Glykolyse, was manche Krebszellen schädigen kann. Es wird daher geprüft, ob 2-DG als Mittel gegen Krebs eingesetzt werden kann. Die Gruppe der Neurobiochemie prüfte in vorangegangenen Untersuchungen die toxischen Effekte einer gleichzeitigen Behandlung mit CBD und 2-DG auf Neuroblastomzellen. In unserer Studie wurden die Effekte dieser Behandlung auf murine mesencephale Primärzellen im Hinblick darauf untersucht, ob die Primärzellen durch die Behandlung mit CBD und 2-DG weniger geschädigt werden als Krebszellen, was Voraussetzung für eine Eignung als Krebsmedikament ist. Weiters wurde im zweiten Teil dieser Arbeit versucht ein in vitro Modell für eine ketogene Diät zu entwickeln. Eine solche Diät wird ebenfalls als Behandlung von Krebs diskutiert. Bei einer ketogenen Diät wird die Kohlenhydratzufuhr stark reduziert. Die Energie wird vorrangig aus Fett und zu einem geringen Anteil aus Protein gewonnen, wodurch Glykolyse stark gehemmt wird und Ketonkörper, wie z. B. BHB als Ersatz verstoffwechselt werden. Manche Krebszellen können ihren Stoffwechsel nicht derart anpassen und werden dadurch geschädigt. In den vorrangegangenen Studien der Gruppe der Neurobiochemie konnten moderate zytotoxische Effekte durch eine Behandlung mit CBD und 2-DG auf Neuroblastomzellen gezeigt werden. Darauf basierend untersuchten wir vorrangig die Wirkung auf Primärzellen. Zudem wurde überprüft, wie sich die ketogene Diät auf Primärzellen auswirkt. Anhand verschiedener Analysemethoden wurden die Auswirkungen auf die Primärzellen gemessen. Um Veränderungen des Zellmetabolismus quantitativ zu bestimmen, wurden Resazurin-Reduktion und ATP-Bestimmungen durchgeführt. Um die Menge der lebenden Zellen zu bestimmen wurden ein BCA-Protein-Assays eingesetzt. Die Zahl der abgestorbenen Zellen wurde anhand der LDH-Aktivität gemessen werden. Um die Auswirkungen der ketogenen Diät zu untersuchen, wurde JC-1 und Hoechst 33342/Propidiumiodid-Fluorimetrie als weitere Parameter herangezogen. Immunozytochemische TH-Fixierung wurde zur Ermittlung der dopaminergen Neuronen angewandt. Die Studie zeigt, dass durch eine partielle Hemmung der Glykolyse mittels 2-DG Neuroblastomzellen und Primärzellen gleichermaßen geschädigt werden. Eine Konzentration von 10 μM CBD ist nachweislich zytotoxisch. Die Kombination von CBD und 2-DG hat minimale zellschädigende Effekte in allen untersuchten Zellkultursystemen erzielt. Da die Behandlung sich jedoch auch negativ auf mesencephale Primärzellen ausgewirkt hat, lässt sich aus unseren Daten schließen, dass sich aus einer Kombination von CBD und 2-DG mit dieser Datenlage keine vielversprechende Behandlung ableiten lässt. Das in vitro Modell für eine ketogene Diät zeigt, dass mesencephale Primärzellen nicht in der Lage sind, die entzogene Glukose mit BHB zu substituieren. Um detaillierte Aussagen zu tätigen, müssen weitere Experimente durchgeführt werden.

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