Titel (deu)

Etablierung einer Methode zur Isolation und Phänotypisierung porziner Basophiler Granulozyten

Autor*in

Patricia Frankova

Betreuer*in

Martina Patzl

Begutachter*in

Barbara Rütgen

Beschreibung (deu)

Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021

Beschreibung (deu)

Zwei Anreicherungsmethoden für Leukozyten aus Vollblut wurden verglichen. Heparinisiertes Blut gesunder Schlachtschweine, das nach der Schlachtung genommen wurde, wurde verwendet. Leukozyten angereichertes Plasma (LEP) wurde durch Verdünnung des Blutes (1:3) mit 3%iger Gelatinelösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewonnen oder es wurde ein Buffy coat (BC) zur Anreicherung verwendet. Mittels LEP konnten beinahe doppelt so viele Zellen isoliert werden, als aus dem BC. Auch die Eliminierung der Erythrozyten war mittels LEP erfolgreicher. Eine Trennung der Leukozytenpopulationen mittels Dichtegradientenzentrifugation wurden mit drei- (1,07; 1,08; 10,9 g/ml), zwei- (10,77; 1,088 g/ml) und einstufigen (1,077 g/ml) Gradienten durchgeführt. Mit Gradienten der Dichte 10,07 – 1,08 g/ml konnten die porzinen Lymphozyten von den restlichen Leukozyten sehr gut getrennt werden. Durchschnittlich 25 % der im Vollblut enthalten Granulozyten konnten isoliert werden. Die in der Anreicherung verbliebenen Erythrozyten waren jedoch mittels Dichtegradientenzentrifugation nicht von den Granulozyten zu trennen. Die porzinen Granulozyten zeigten eine Dichte zwischen 1,088 g/ml und 1,09 g/ml und wiesen daher verglichen mit humanen Basophilen eine höhere Dichte auf. Von allen Zellfraktionen nach Anreicherung und Dichtegradientenzentrifugation wurden Ausstriche angefertigt, in denen mikroskopisch nach Färbung mit Diff-Quick oder Toluidinblau die relative Häufigkeit der einzelnen Leukozytenpopulationen ermittelt wurde. Bei 80 % der untersuchten Blutproben konnten in der Granulozytenfraktion Basophile in den mit Toluidinblau gefärbten Ausstrichen gefunden werden. Zur Darstellung der Granulozyten mittels Durchflusszytometrie wurden folgende Marker verwendet: CD52, CD172a, CD14 und anti porzines (p) IgE. Basophile wurden definiert als CD52+ CD172a+ CD14- und anti pIgE+. Obwohl Basophile eindeutig in den gefärbten Ausstrichen nachgewiesen wurden, ist es nicht gelungen, sie für eine FCM Messung eindeutig zu markieren. Eine mögliche Erklärung für diesen Befund wäre, dass die Basophilen gesunder Tiere den hochaffinen IgE Rezeptor nur schwach exprimierten und daher auch wenig IgE an der Zelloberfläche gebunden war, oder zwar Rezeptoren vorhanden waren, aber diese kein IgE gebunden hatten.

Beschreibung (eng)

Two methods for enrichment of leukocytes from whole blood were compared: leukocyte enriched plasma (LEP) and buffy coat (BC). Heparinized blood from healthy pigs from an abattoir was used. LEP was gained by sedimentation of erythrocytes (RBC) by diluting blood 1:3 with 3 % gelatine in phosphate buffered saline and almost twice as many cells could be isolated compared to BC. Elimination of RBC was also more successful with LEP. On average 25 % of the granulocytes contained in whole blood could be isolated. Further separation of leukocytes by means of a density gradient centrifugation was carried out with three- (1.07; 1.08; 10.9 g/ml), two- (1.077; 1.088 g/ml) and one-stage (1.077 g/ml) gradients. With densities of 1.077 - 1.08 g/ml porcine lymphocytes could be separated very well from the remaining leukocytes. However, RBC remaining within the granulocyte rich fraction could only be removed partially. Based on these results, the porcine granulocytes exhibited a density between 1.088 g/ml and 1.09 g/ml. Compared to human basophils, the porcine showed a higher density. Smears were prepared from all cell fractions after enrichment and density gradient centrifugation to document the process. After staining with Diff-Quick or Toluidine blue the smears were examined microscopically. In 80 % of the examined blood samples stained with toluidine blue basophils were found in the smears of the layer upon the 1,088 g/ml. To differentiate the granulocytes by flow cytometry following markers were used: CD52, CD172a, CD14 and anti-porcine (p) IgE. Basophils were defined as CD52+ CD172a+ CD14- and anti pIgE+. Although basophils were clearly detected in the stained smears, it was not possible to stain them specifically for FCM. A possible explanation would be that the basophils of healthy animals only weakly express the high-affinity IgE receptor (FcεRI) and therefore little IgE was bound to the cell surface, or that receptors were present but not saturated with IgE.

Sprache des Objekts

Deutsch

Datum

2021

Rechte

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