Diploma thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2021

Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021

In 2014, two thirds of the sold drinking milk products were ultra-high temperature (UHT) milk. Raw milk which is selected for UHT processing has to be in a good microbiological condition, EU Directive No 326/2015 establishes microbiological quality criteria for bovine raw milk used for further milk processing and in EU Regulation No 2073/2005 and No 853/2004 the criteria for bacterial contamination in bovine raw milk aimed for UHT processing are listed. Diaries have to ensure these legal requirements with their HACCP schedule. Due to increased spoilage and reduced shelf life stability of UHT products, raw milk should not contain high counts of heat resistant spores from spore-forming bacteria like Bacillus and Bacillus like species and heat resistant enzymes from non- spore-forming psychrotrophic bacteria, e.g. Pseudomonas spp. In this diploma thesis the bacterial residues in rinse water after cleaning in place (CIP) in aseptic milk processing lines in an Austrian scale dairy were examined in order to evaluate the presence of bacteria producing heat resistant spores and heat resistant enzymes in comparison to bacteria associated with post sterilisation contamination. For 6 months the rinse water of twelve sterile equipments including the Asepto (ultra-high temperature) UHT heating system, eight aseptic tanks, two aseptic packaging machines for milk products, the aseptic fresh water tank and the non-sterile milk pasteur were collected for three times (S1-S3). All sterile and unsterile equipments of this study are cleaned by one CIP station comprising three circuits (51 to 53). The rinse water was collected under sterile conditions and after sterile water filtration, bacteria were isolated using unselective and selective agar plates incubated at temperatures corresponding to the optimal temperatures of hygiene indicators and potential pathogenic bacteria. Single colonies were characterized by colony morphology and classical bacteria differentiation and purified bacteria isolates were confirmed by 16S rRNA gene sequencing in order to allow risk assessment of the isolated bacteria. In S1-S3, an isolation set of 217 bacteria could be collected. The bacterial isolates collected during sampling event S1-S3 were associated to more than the half to Gram positive (53.90%; n=117/217) and to a smaller extend to Gram negative bacteria (46.10%; n=100/217). Recontaminants (n=108/217; 49.77%) were most gram-negative bacterial organisms and staphylococci detected in this study. Thermoduric bacteria (n=109/217; 50.23%) were identified as aerobic spore formers (Bacillaceae and Paenibacillaceae), Micrococcaceae, Microbacteriaceae, Streptococcaceae, Caryophanales, Mycobacteriaceae and Deincoccaceae. The most abundant bacterial genera were Acinetobacter (n=50/217; 23.04%), Kocuria (n=30/217; 13.82%), Microbacterium (n=25/217; 11.52%), Pseudomonas (n=16/217; 7.37%), Micrococcus and Lactococcus (each 10/217; 4.61%). Generally, A. johnsonii, A. iwoffi (both risk group 2) and A. radioresistens are highly associated to the human niche. Aerobic spore formers are perfectly adapted to milk processing environment, are thermoduric and opportunistic pathogenes (B. cereus group). Kocuria (thermoduric) are risk group 1 organisms and are often isolated from environment. The bacterial reservoir in the UHT milk processing line was heterogeneous in composition during the three sampling events. Overall, only sterile tank 2140 was tested negative for recontaminants or thermoduric bacterial organisms in all three sampling events. The residual rinse water in sterile tank 2136 contained the greatest bacterial diversity at all three sampling times. The highest amount of bacterial species (n=10) was detected in the fresh water tank, a reservoir for the CIP system. For this reason, the verification of the CIP process of the sterile equipments is necessary to detect critical points in the milk processing lines where attached biofilms decrease cleaning efficiency of the CIP procedure. An alternative sampling technique with less recontamination potential within the verification process like swabbing is recommended to confirm the presence of specific bacteria. As all sterile and unsterile equipments of this study are cleaned by one CIP station and the rinsing water for the CIP process is used from fresh water tank 2143, the microbiological water quality of the cleaning water has to be observed critical. The identification of fresh water tank 2143 as a reservoir for diverse Gram-negative recontaminants proposes a repeated sampling and sterile filtration of the cleaning water. The use of selective agar plates incubated at temperatures corresponding to the optimal temperatures of hygiene indicators and potential pathogenic bacteria with a following 16S rRNA gene sequencing in order to allow risk assessment is recommended. Appropriate treated wastewater regarding economical and ecological viewpoints is an alternative to potable water for CIP applications. As raw milk with a good microbiological condition is necessary to ensure the production of a high quality UHT product with a stable shelf life, the use of raw milk classified to S class (SPC ≤50 000/ml, SCC ≤250 000/ml) is an opportunity to reduce the spoilage risk of UHT milk products through contamination with heat resistant enzymes from non-spore forming psychrotrophic bacteria and heat resistant spores being produced from bacteria originated in raw milk. In general, the critical microbiological observation of UHT processing equipment including cleaning and disinfection management deserve special consideration of dairy manufacture

Im Jahr 2014 stellten zwei Drittel der weltweit verkauften Trinkmilchprodukte UHT Produkte dar. Rohmilch, die für die UHT Weiterverarbeitung bestimmt ist, muss eine hohe mikrobiologische Qualität nachweisen. Die erforderlichen mikrobiologischen Qualitätskriterien für Kuhmilch sind gesetzlich in den EU Richtlinien Nr. 2073/2005 und Nr. 853/2004 geregelt. Milchverarbeitende Betriebe müssen diese gesetzlichen Anforderungen im Rahmen ihres HACCP Plans erfüllen. Aufgrund einer verminderten Mindesthaltbarkeitsdauer und Produktstabilität bei Raumtemperatur, sollte in Rohmilch, die zu UHT Milch weiterverarbeitet wird, keine hohe Anzahl an hitzeresistenten Sporen sporenbildender Bakterien wie Bacillus und Bacillus ähnlichen Spezies sowie an hitzeresistenten Enzymen psychrotropher Bakterien wie Pseudomonas spp. enthalten sein. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden die bakteriellen Rückstände nach stationärer CIP Reinigung im Nachspülwasser aseptischer milchverarbeitender Produktionsanlagen in einer österreichischen Molkerei untersucht, um das Verderbnisrisiko durch hitzeresistente, sporenbildendende Bakterien sowie enzymproduzierender Bakterien als potentielle Rekontaminanten zu evaluieren. Für eine Dauer von 6 Monaten wurden die Nachspülwasserproben von zwölf Probenahmestellen jeweils dreimal untersucht. Zu diesen Probenahmestellen zählten ein UHT Erhitzer, acht Steriltanks, zwei aseptische Abfüllanlagen für Trinkmilchprodukte, ein für die CIP Reinigung verwendeter Frischwassertank sowie ein Milchpasteur. Alle sterilen und unsterilen Probenahmestellen wurden von einer CIP Station (Kreislauf 51-53) gereinigt. Das Nachspülwasser wurde unter aseptischen Bedingungen gesammelt und sterilfiltriert. Die Isolierung der Bakterien erfolgte durch selektive und unselektive Nährmedien, die entsprechend den Wachstumsanforderungen der Hygieneindikatoren sowie potenzieller bakterieller Pathogene inkubiert wurden. Die kultivierten Isolate wurden durch die klassische Grobdifferenzierung charakterisiert, aufgereinigt und durch 16S rRNA Genanalyse identifiziert. Es stand ein Isolatset von 217 Keimen zur Verfügung. Die identifizierten Isolate der Probennahmedurchgänge 1-3 setzten sich zu 53,90% aus Gram positiven Keimen (n=117/217) sowie zu 46,10% aus Gram negativen Keimen zusammen. Die Rekontaminationskeime (n=108/217; 49,77%) stellten Gram negative Bakterien sowie Staphylococci dar. Als thermodure Bakterien (n=109/217; 50,23%) konnten aerobe Sporenbildner (Bacillaceae und Paenibacillaceae), Micrococcaceae, Microbacteriaceae, Streptococcaceae, Caryophanales, Mycobacteriaceae und Deincoccaceae identifiziert werden. Die am häufigsten isolierten Bakteriengenera stellten Acinetobacter (n=50/217; 23,04%), Kocuria (n=30/217; 13,82%), Microbacterium (n=25/217; 11,52%), Pseudomonas (n=16/217; 7,37%), Micrococcus und Lactococcus (jeweils 10/217; 4,61%) dar. A. johnsonii, A. iwoffi (jeweils Risikogruppe 2) und A. radioresistens werden als humanassoziierte Keime beschrieben. Aerobe Sporenbilder sind Kontaminationskeime milchverarbeitender Oberflächen, zeigen thermodures Verhalten und können opportunistisch pathogen (B. cereus Gruppe) sein. Kocuria ist ein thermodurer umweltassoziierter Keim und zählt zur Risikogruppe 1. Das Keimreservoir der UHT milchverarbeitenden Prozessanlagen stellte sich in den Probennahmedurchgängen 1-3 als heterogen dar. Der Steriltank 2140 war die einzige Probenahmestelle, aus dessen Nachspülwasser keine bakteriellen Rückstände isoliert werden konnten. Das Nachspülwasser von Steriltank 2136 zeigte in allen Probennahmedurchgängen die größte bakterielle Diversität. Die meisten Bakterienspezies (n=10) konnten im Frischwassertank 2143 nachgewiesen werden. Anhand der Versuchsergebnisse ist die Verifizierung des CIP Regimes der aseptischen milchverarbeitenden Prozessanlagen notwendig, da Biofilme an kritischen Oberflächen die Reinigungseffizienz des CIP Regimes vermindern. Im Rahmen der Verifizierung ist eine alternative Probenahmetechnik (z.B. Tupferprobe) zur Nachspülwasseruntersuchung sinnvoll, um das Rekontaminationsrisiko der Proben durch die Probenahme zu reduzieren. Da alle untersuchten Probenahmestellen vom Spülwasser des Frischwassertanks 2143 gereinigt werden, muss die mikrobiologische Wasserqualität des Spülwassers evaluiert werden. Aufgrund der Identifizierung des Frischwassertanks als Reservoir für Gram negative Rekontaminationskeime, empfiehlt sich eine wiederholte Beprobung und Sterilfiltration des Spülwassers aus Tank 2143. Um eine Risikobewertung der Ergebnisse zu ermöglichen, sollte nach der Keimisolation durch selektive Nährmedien, die entsprechend der Wachstumsanforderungen der Hygieneindikatoren sowie potenzieller bakterieller Pathogene inkubiert werden, eine 16S rRNA Genanalyse folgen. Die Verwendung von aufbereitetem Abwasser der Milchproduktion ist hinsichtlich ökologischer und wirtschaftlicher Faktoren eine Alternative zur Verwendung von Trinkwasser für CIP Reinigungsabläufe. Da Rohmilch mit einer geringen mikrobiologischen Belastung für die Produktion von UHT Milch mit einer stabilen Haltbarkeit notwendig ist, sollte nur Rohmilch der S-Klasse (Keimzahl ≤50 000/ml, Zellzahl ≤250 000/ml) verarbeitet werden, um das Verderbnisrisiko durch hitzeresistente Sporen und Enzymen aus der Rohmilchflora zu minimieren. Milchverarbeitende Betriebe sollten die Reinigungs-und Desinfektionsmaßnahmen der aseptisch milchverarbeitenden Anlagen im Rahmen ihres HACCP stets kritisch kontrollieren.

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