Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021

Insgesamt wurden 27 Mykoplasmen-Isolate, die aus 22 Humboldt-Pinguinen (Spheniscus humboldti) isoliert wurden und keiner valide beschriebenen Art zugeordnet werden können, in dieser Arbeit untersucht. Die Isolate stammen vorrangig aus dem Respirationstrakt von verendeten Exemplaren der Humboldt-Pinguin-Kolonie des Tiergartens Schönbrunn, Wien. Die für alle Isolate, mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie generierten Spektren, ergaben für 26 Isolate keine Übereinstimmungen mit bekannten Mykoplasmenarten und konnten in sechs mögliche neue Arten unterteilt werden. Ein Isolat wurde als M. tullyi identifiziert. Zur Untersuchung der Kolonie- und Zellmorphologie der unbekannten Arten, wurden einzelne Isolate ausgewählt. Aufgrund der Ergebnisse der MALDI-TOF Massenspektrometrie wurden die Isolate der Gattung Mycoplasma zugeordnet. Die phylogenetische Positionierung wurde durch 16S rRNA-Gen, 16S-23S intergenetische Spacer- und partielle rpoB- Gensequenzanalyse bestimmt und Sequenzähnlichkeitswerte durch den Vergleich mit Einträgen in der öffentlichen GenBank-Datenbank unter Anwendung des BLAST- Algorithmus ermittelt. Die Isolate wurden den entsprechenden, auf den 16S rRNA- Gensequenzen beruhenden phylogenetischen Clustern zugeordnet und anschließend wurden die ermittelten Sequenzen mit den aus dem Genbank-Datenpool extrahierten Sequenzen der Typstämme, unter Anwendung des ClustalW-Alignments ausgerichtet. Neighbour-Joining- Distanzanalysen mit Bootstrapping (1000 Replikationen) unter Einsatz des Kimura-2- Parameter-Substitutionsmodells (Dayhoff-Modell für rpoB-Aminosäurensequenzen) wurden durchgeführt (MEGA 6 Software) und die phylogenetischen Verwandtschaftsverhältnisse anhand der konstruierten Stammbäume dargestellt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich um neue Spezies handelt. Die Protein-Analyse mittels SDS PAGE wurde für die Isolate und ihre nächst verwandten Mykoplasmenarten durchgeführt. Diese Untersuchung ergab identische Bandenprofile für die Isolate innerhalb einer Gruppe, welche sich deutlich von den Bandenprofilen der Vergleichsstämme unterscheiden. Isolate der Mycoplasma sp. A-Gruppe zeigten auch in der Western-Blot-Analyse identische Reaktionsmuster, die sich von denen der nächst verwandten Mykoplasmenarten unterschieden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die untersuchten Mykoplasmen-Isolate keiner valide beschriebenen Art angehören. Es konnte eine solide Basis für die Speziesneubeschreibung geschaffen werden.

In total, 27 Mycoplasma isolates, which have been isolated from 22 Humboldt penguins (Spheniscus humboldti) and can’t be identified as a valid described species, were investigated in this study. The majority of the isolates were retrieved from the respiratory tract of dead specimen of the Humboldt-penguin-colony of the Zoo Vienna. Using MALDI-ToF Mass spectrometry, spectra were generated and 26 of them couldn’t be assigned to a known Mycoplasma species and seemed to represent six new species. One of the isolates was identified as M. tullyi. Individual isolates were chosen to examine their colony and cell morphology. The results of the MALDI-ToF MS enabled the isolates to be assigned to the genus Mycoplasma. The phylogenetic positioning was achieved through 16S rRNA-gene, 16S-23S intergenic Spacer and partial rpoB-gene sequence analysis and sequence similarity values were investigated by comparing them to sequences in the GenBank database using the BLAST-Algorithm. The isolates were assigned to their phylogenetic clusters based on the 16S rRNA gene sequences and further on the sequences were aligned with sequences of the type strains, extracted from the GenBank data pool, by using ClustalW-Alignments. Neighbour Joining Distance analysis with bootstrapping (1000 replications), using Kimura 2-parameter Substitution model (Dayhoff model for rpoB amino acids) were executed and the phylogenetic relations depicted by the constructed phylogenetic trees. The results indicate that the isolates represent new Mycoplasma species. Protein analysis was performed by SDS PAGE for the isolates and their closely related Mycoplasma species. The generated banding patterns of the isolates within one group are identical and can be clearly differentiated from those of the type strains used for comparison. Isolates of the Mycoplasma sp. A group showed identical banding patters in the western blot analysis as well and could again be differentiated from the closely related Mycoplasma species. The results of this study confirm that the examined Mycoplasma isolates do not belong to a valid described species. A solid base for their further description was provided.

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