Titel (deu)

Methodenvergleich zum Nachweis von Kryptosporidien in Kälberkot

Autor*in

Katharina Freudenthaler

Betreuer*in

Thomas Wittek

Anja Joachim

Begutachter*in

Peter Schmidt

Beschreibung (deu)

Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020

Beschreibung (deu)

Ziele dieser Arbeit waren, Nachweismethoden für Kryptosporidien in Kälberkot zu validieren und die Übereinstimmung dieser zu überprüfen, sowie Kryptosporidienspezies in an Durchfall erkrankten Kälbern zu identifizieren. Kotproben wurden direkt aus dem Rektum von an Durchfall erkrankten Kälbern gezogen. Es kamen drei Testsysteme zum Einsatz (Phasenkontrastmikroskopie, Schnelltest, PCR), als Referenzmethode galt die Mikroskopie. Zwei Durchgänge mit einem kommerziell erhältlichem Schnelltest zum Nachweis von Cryptosporidium parvum wurden durchgeführt und zwei PCR-Protokolle etabliert, einerseits zum spezifischen Nachweis von Cryptosporidium parvum (gp60 Lokus) und andererseits zum Nachweis von Cryptosporidium spp. (18S rDNA). Die PCR-Produkte der positiven Proben wurden sequenziert. In der Phasenkontrastmikroskopie wurden in 55,4 % der Proben Oozysten nachgewiesen, mithilfe des Schnelltests wurden im ersten Durchgang (n=177) 46,9 % und im zweiten Durchgang (n=130) 53,0 % positiv getestet. Die Validitätskriterien für den eingesetzten Schnelltest ergaben eine Sensitivität von 77,6 % (erster Durchgang) bzw. 82,9 % (zweiter Durchgang), eine Spezifität von 91,1 % bzw. 88,9 %, einen negativen prädiktiven Wert von 76,6 % bzw. 78,7 %, einen positiven prädiktiven Wert von 91,6 % bzw. 91,3 %, eine prozentuale Übereinstimmung zur Referenzmethode von 83,6 % bzw. 85,4 % und einen Cohen‘s Kappa von 0,67 bzw. 0,71. Von allen Mikroskopie-positiven Proben (n=98) wurde eine gp60–PCR durchgeführt. Dabei zeigten 68,4 % ein positives Ergebnis, die 31 negativen Proben wurden weiters mittels 18S- PCR gescreent, welche in 32,3 % ein positives Ergebnis lieferte. Von den Mikrospie-negativen Proben (n=79) wurde eine 18S-PCR durchgeführt, diese ergab bei 19,0 % ein positives Ergebnis. Insgesamt wurden 93 DNA–Produkte sequenziert und davon 79,3 % als Cryptosporidium parvum, 8,7 % als Cryptosporidium bovis und 12 % als Cryptosporidium ryanae bestätigt. Bei der Subtypisierung von Cryptosporidum parvum wurden vier Subtypen (IIaA15G2R1, IIaA14G1R, IIaA21G2R1, IIaA19G2R1) detektiert. Berechnungen zur Übereinstimmung der Methoden ergaben einen Cohen‘s Kappa von 0,24 für Phasenkontrastmikroskopie und 18S-PCR, 0,67 für Phasenkontrastmikroskopie und Schnelltest und 0,35 für 18S-PCR und Schnelltest. Es konnten hohe Validitätskriterien für den kommerziellen Schnelltest festgestellt werden. Außerdem wurde bestätigt, dass neben Crpytosporidium parvum auch Cryptosporidium bovis und Crytposporidium ryanae bei jungen Kälbern mit Durchfall vorkommen, es besteht allerdings ein Zusammenhang zwischen der vorkommenden Spezies und dem Alter der Tiere. Die Übereinstimmung der verschiedenen Nachweismethoden ist als mäßig gut zu bewerten, die PCR kann als sensitivere Methode gegenüber der Phasenkontrastmikroskopie angesehen werden.

Beschreibung (eng)

The aim of this study was to compare and evaluate different detection methods for Cryptosporidium in faecal samples of calves and to further characterize the Cryptosporidia on a species level. Faecal specimens were collected per rectum of diarrhoic calves. Three detection methods were implemented: Phase contrast microscopy, a commercial immunochromatographic point of care test and PCR. Microscopy was used as the reference method, the point of care test was carried out twice (in the field and following freezing-thrawing in the lab). Two different protocols for PCR were performed, for the detection of Cryptosporidium spp. (18S locus) and for the detection of Cryptosporidium parvum (gp60 locus). PCR-products of positive samples were analysed by DNA-sequencing. Upon examination with phase contrast microscopy 55.4 % of the samples were positive for Cryptosporidium oocysts. In the field the point of care test showed positive results in 46.9 % (n=177) of the analyzed samples. In the laboratory the test yielded positive results in 53.0 % (n=130). Calculation of validity criteria showed a sensitivity of 77.6 % (field study) and 82.9 % (lab), a specifity of 91.1 % and 88.9 %, respectively, a negative predictive value of 76.6 % and 78.7 %, a positive predictive value of 91.6 % and 91.3 %, respectively. Percentage of agreement between point of care test and phase contrast microscopy was 83.6 % and 85.4 % and Cohen‘s Kappa coefficient yielded 0.67 and 0.71, respectively. Samples tested positive using phase contrast microscopy were screened with gp60-PCR (n=98), where 68.4 % showed a positive result. Thirty-one specimens were further screened with 18S- PCR, where 32.3 % were positive. Samples tested negative with phase contrast microscopy were screened with 18S-PCR (n=79), where 19.0 % were tested positive. DNA-products (n=93) were sent to another laboratory for DNA-sequencing. 79.3 % were identified as Cryptosporidium parvum, 8.7 % as Cryptosporidiumm bovis and 12.0 % as Cryptosporidium ryanae. Subtyping of Cryptosporidium parvum showed four different subtypes (IIaA15G2R1, IIaA14G1R, IIaA21G2R1, IIaA19G2R1). The agreement between different detection methods was calculated with Cohen‘s Kappa coefficient and yielded 0.24 for phase contrast microscopy and 18S-PCR, 0.67 for phase contrast microscopy and point of care test and 0.35 for 18S-PCR and point of care test. Validation of the point of care test showed good results. With PCR it was confirmed that besides Cryptosporidium parvum also Cryptosporidium ryanae and Cryptosporidium bovis can be found in diarrhoic calves. Agreement between different detection methods showed rather poor results, PCR can be stated to be more sensitive than phase contrast microscopy.

Sprache des Objekts

Deutsch

Datum

2020

Rechte

© Alle Rechte vorbehalten

Mitglied in der/den Collection(s) (2)

o:72 Hochschulschriften / Veterinärmedizinische Universität Wien
o:2549 Diplomarbeiten / Veterinärmedizinische Universität Wien

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