PhD thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023

Liver dysfunction constitutes a serious complication in sepsis contributing to disease progression and death. It is supposed to result from a functional impairment of parenchymal cells induced by metabolic changes going along systemic inflammation. There exists evidence suggesting that disturbance of protein folding machinery, a condition called endoplasmic reticulum (ER) stress and subsequent induction of the unfolded protein response (UPR) are involved in these processes. Whether the initial triggers of hepatic ER stress and UPR are associated with tissue trauma or infection has not been addressed so far. Upon systemic inflammation heme oxygenase (HO) and nitric oxide synthase (NOS) activities are markedly increased due to up-regulation of stress inducible enzymes HO-1 and inducible NOS (iNOS). The activities of both enzymes are interactive and assumed to be involved in onset and shaping of the UPR and inflammatory response. Thus, in the first part of this thesis, we aimed to dissect the role of infection and injury on the progression of HO-1 and iNOS gene expression in parallel with UPR markers in liver in a clinically relevant sepsis model. The aim of the second part of this thesis was to recapitulate the observed changes in hepatocytes and macrophages as they are considered key players in the development of liver dysfunction. In the hepatocyte cell line BRL3A we studied the protective role of the HO reaction and the HO product bilirubin against heme induced oxidative damage of mitochondria and ER. In macrophage cell line J774A.1 we studied the interplay of HO and NOS activity and their effects on the functional activity and stress response of macrophages under resting and inflammatory conditions. Our results show, that ER-stress was not primarily associated with infection but with tissue damage in moderate sepsis. In contrast, HO-1 and iNOS were up-regulated in context with inflammatory response. Increased HO activity in hepatocytes directly protects mitochondria from heme induced oxidative damage by removal of heme, while bilirubin triggers UPR. In macrophages HO and NOS independently regulate main macrophage functions. NOS supports bactericidal activity by enhancing NADPH oxidase activity via increased mitochondrial reactive oxygen species production. HO supports phagocytosis by heme degradation, which is also involved in lipopolysaccharide induced UPR signaling. High levels of HO products dampen pro-inflammatory response in macrophages by down-modulating iNOS possibly in a UPR dependent manner. To summarize, our data show that upon moderate sepsis HO activity exerts a beneficial effect on liver ameliorating mitochondrial function and modulating macrophage activity.

PhD Thesis - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023

Leberfunktionsstörungen stellen eine schwerwiegende Komplikation bei Sepsis dar, die zum Fortschreiten der Krankheit und zum Tod beiträgt. Die Ursache wird auf die durch systemische Entzündung hervorgerufenen Stoffwechselveränderungen und daraus resultierende Funktionsbeeinträchtigung parenchymaler Zellen zurückgeführt. Eine Störung der Proteinfaltungsmaschinerie, welche als endoplasmatischer Retikulums (ER) Stress bezeichnet wird und die dadurch eingeleitete „unfolded protein response“ (UPR) sollen an diesem Prozessen beteiligt sein. Ob die primären Auslöser von hepatischem ER-Stress und UPR mit einem Gewebetrauma oder einer Infektion zusammenhängen, wurde bisher nicht untersucht. Bei systemischen Entzündungen sind durch Hochregulierung der stressinduzierbaren Enzyme Hämoxygenase (HO)-1 und der induzierbaren Stickstoffmonoxid- Synthase (iNOS) die entsprechenden enzymatischen Aktivitäten deutlich erhöht. Diese wechselwirken miteinander und es wird angenommen, dass sie an der Einleitung und Regulation von UPR und Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Daher untersuchten wir im ersten Teil dieser Arbeit die Rolle von Entzündung und Verletzungen auf den Verlauf der Genexpression von HO-1 und iNOS parallel zu UPRMarkern in der Leber in einem klinisch relevanten Sepsis-Modell. Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war es, die beobachteten Veränderungen in Hepatozyten und Makrophagen nachzustellen, da diese als Schlüsselakteure bei der Entwicklung von Leberfunktionsstörungen gelten. In der Hepatozyten-Zelllinie BRL3A untersuchten wir die schützende Rolle der HO-Reaktion und des HO-Produkts Bilirubin gegen Häm-induzierte oxidative Schäden an Mitochondrien und ER. In der Makrophagen-Zelllinie J774A.1 untersuchten wir das Zusammenspiel von HO und NOS-Aktivität und ihre Auswirkungen auf Funktion und Stressreaktion von Makrophagen unter Ruhe- und Entzündungsbedingungen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ER-Stress bei moderater Sepsis nicht primär mit Infektionen, sondern mit Gewebeschäden assoziiert war. Im Gegensatz dazu wurden HO-1 und iNOS im Zusammenhang mit der Entzündungsreaktion hochreguliert. Eine erhöhte HO-Aktivität in Hepatozyten schützt die Mitochondrien durch Abbau von Häm direkt vor oxidativen Schäden, während Bilirubin UPR auslöst. In Makrophagen regulieren HO und NOS unabhängig voneinander die wichtigsten Makrophagenfunktionen. NOS unterstützt die bakterizide Aktivität, indem es, über eine erhöhte Produktion mitochondrialer reaktiver Sauerstoffspezies, die Aktivität der NADPH-Oxidase steigert. HO unterstützt die Phagozytose durch Häm-Abbau, der auch die Lipopolysaccharid-induzierten UPR-Signalübertragungswege beeinflusst. Hohe Mengen an HO-Produkten dämpfen eine proinflammatorische Reaktion in Makrophagen, indem sie iNOS, möglicherweise in einer UPR-abhängigen Weise, heruntermodulieren. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass die HO-Aktivität bei moderater Sepsis eine positive Wirkung auf die Leber ausübt, indem sie die mitochondriale Funktion verbessert und die Makrophagenaktivität moduliert.

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VII, 115 Blätter