Investigating genetic dependencies of STAT3-driven hematological malignancies

PhD thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023 The full text is only available to university members. Please log in!

CDK4 and CDK6 are best known for their roles in regulating the mammalian cell cycle. Alterations in cell cycle regulation are found in 40% of all human cancers and represent a main driver of carcinogenesis. The development of small-molecule inhibitors targeting CDK4/6, now approved for the treatment of patients with breast and lung cancer, was a breakthrough in cancer therapy. However, common side effects include haematological abnormalities such as neutropenia and anaemia. To understand whether the observed side-effects that are frequently observed within the hematopoietic system relate to CDK4 or CDK6, we developed transgenic mouse models that allow the inducible conditional deletion of either CDK4 or CDK6 in the hematopoietic system of adult animals. These model systems allowed us to show that anaemia and neutropenia are in fact evoked through the loss of CDK6 but not CDK4, which was accompanied by increased hematopoietic stem cell populations upon CDK6 deletion. Together, this suggests that accumulation of dormant hematopoietic stem cells combined with impaired differentiation programs is likely responsible for the observed side effects that are found in the haematopoietic lineage in patients treated with CDK4/6 inhibitors. Several of our observations were in contrast to previous findings that relied on mouse models with CDK6 deletions in all tissues. This highlights the necessity of model systems allowing inducible gene deletions in adult animals to mimic drug response in patients. Our newly developed mouse model will lay the foundation for future studies on the specific roles of CDK4 and CDK6 in any cell-type in an inducible manner. The second part of this thesis focuses on the transcription factor STAT3, that has important roles in regulating survival, growth, inflammation and cellular differentiation. Recently, gain-of-function mutations within the SH2 domain of STAT3 have been identified, predominantly in patients suffering from LGLL. Among those, STAT3Y640F represents the most frequently found alteration. As transcription factors are notoriously difficult to target pharmacologically, a better understanding of STAT3-dependent transcriptional co-factors and their molecular targets is critical to identify and develop novel therapeutic approaches. To unravel the molecular mechanisms behind STAT3-mutation-induced malignancies, we transformed murine hematopoietic stem and progenitor cells through ectopic expression of STAT3Y640F. Our murine model system recapitulated common transcriptional features, such as a strong inflammatory gene expression signature, that is also found in T-LGLL cells from patients harbouring STAT3 mutations. Gene expression analyses combined with chromatin occupancy profiling of mutated STAT3Y640F identified a core set of direct transcriptional targets, which we further interrogated for their functional relevance using genome-wide CRISPR/Cas9-based loss-of-function screens. Among those, we identified the gene SBNO2 as an essential direct transcriptional target of STAT3Y640F. In addition to STAT3-mutation-driven NK-cell leukaemia, the STAT3-SBNO2 axis was also critical for STAT3 mutated T-cell non-Hodgkin-lymphoma and NPM-ALK-rearranged T-anaplastic large cell lymphoma that both are driven by hyperactive STAT3 signalling. Accordingly, knockdown of SBNO2 represented a selective vulnerability of all STAT3-signaling-driven hematopoietic malignancies but was completely dispensable for other disease contexts. Moreover, high SBNO2 expression in NPM-ALK-rearranged T-anaplastic large cell lymphoma patients correlated with shorter relapse-free and overall survival. Taken together, the STAT3/SBNO2 axis represents a novel prognostic factor and a promising future therapeutic intervention site in STAT3-driven hematopoietic malignancies.

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CDK4 und CDK6 sind am besten für ihre Rolle bei der Regulierung des Zellzyklus von Säugetieren bekannt. Veränderungen in der Zellzyklusregulierung finden sich bei 40 % aller menschlichen Krebsarten und sind ein wichtiger Faktor bei der Krebsentstehung. Die Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren, die auf CDK4/6 abzielen und nun für die Behandlung von PatientInnen mit Brust- und Lungenkrebs zugelassen sind, war ein Durchbruch in der Krebstherapie. Zu den häufigen Nebenwirkungen gehören jedoch hämatologische Anomalien wie Neutropenie und Anämie. Um zu verstehen, ob die beobachteten Nebenwirkungen im blutbildenden System mit CDK4 oder mit CDK6 zusammenhängen, haben wir transgene Mausmodelle, die eine induzierbare Deletion von CDK4 oder CDK6 bei erwachsenen Tieren im hämatopoetischen System ermöglichen, entwickelt. Anhand dieser Modellsysteme konnten wir zeigen, dass Anämie und Neutropenie tatsächlich durch den Verlust von CDK6, nicht aber von CDK4, verursacht werden, was mit einer Zunahme der hämatopoetischen Stammzellpopulationen nach Deletion von CDK6 einherging. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass die Anhäufung von ruhenden hämatopoetischen Stammzellen in Kombination mit gestörten Differenzierungsprogrammen wahrscheinlich für die beobachteten Nebenwirkungen im hämatopoetischen System von PatientInnen, welche mit CDK4/6-Inhibitoren behandelt werden, verantwortlich sind. Mehrere unserer Ergebnisse stehen im Gegensatz zu früheren Erkenntnissen, welche sich auf Mausmodelle mit CDK6-Deletionen in allen Geweben stützten. Dies unterstreicht den Bedarf an Modellsystemen, die induzierbare Gendeletionen in erwachsenen Tieren ermöglichen, um die Arzneimittelreaktion bei PatientInnen nachzuahmen. Unser neu entwickeltes Mausmodell ermöglicht die Erforschung spezifischer Rollen von CDK4 und CDK6 in beliebigen Zelltypen auf induzierbare Weise. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf den Transkriptionsfaktor STAT3, der eine wichtige Rolle bei der Regulierung von Überleben, Wachstum, Entzündung und zellulärer Differenzierung spielt. Kürzlich wurden „Gain-of-Function“ Mutationen innerhalb der SH2-Domäne von STAT3 identifiziert, insbesondere bei PatientInnen mit LGL Leukämie. Innerhalb dieser Mutationen ist STAT3Y640F die am häufigsten gefundene genetische Veränderung. Da sich Transkriptionsfaktoren pharmakologisch nur schwer inhibieren lassen, ist ein besseres Verständnis der STAT3-abhängigen Transkriptionsfaktoren und ihrer molekularen Ziele für die Identifizierung und Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze von entscheidender Bedeutung. Um die molekularen Mechanismen hinter den durch STAT3-Mutationen ausgelösten malignen Erkrankungen zu entschlüsseln, haben wir murine hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen durch ektopische Expression von STAT3Y640F transformiert. Unser murines Modellsystem rekapitulierte Transkriptionsmerkmale, wie z. B. eine starke entzündliche Genexpressionssignatur, die wir auch in T-LGL Leukämie Zellen von PatientInnen mit STAT3-Mutationen fanden. Genexpressionsanalysen in Kombination mit Chromatinprofilierung von mutiertem STAT3Y640F resultierten in einem Kern direkter Transkriptionsziele, welche wir mit genomweiten CRISPR/Cas9-basierten „Loss-of-Function“-Screens auf ihre funktionelle Bedeutung untersuchten. Innerhalb dieser identifizierten wir das Gen SBNO2 als ein wichtiges direktes transkriptionelles Ziel von STAT3Y640F. Neben der durch STAT3-Mutation ausgelösten NK-Zell-Leukämie war die STAT3-SBNO2-Achse auch für das T-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom und das NPM-ALK-exprimierende anaplastisch-großzellige T-Lymphom wichtig, welche beide durch hyperaktives STAT3-Signaling getrieben werden. Die Inhibierung von SBNO2 stellt eine selektive Vulnerabilität in allen hämatopoetischen Krebserkrankungen, die durchhyperaktives STAT3 Signaling getrieben werden, dar, ist aber für andere Krankheitskontexte entbehrlich. Weiters korreliert eine hohe SBNO2 Genexpression mit einem kürzeren Rückfallfreien- und Gesamtüberleben bei anaplastisch-großzellige T-Lymphom PatientInnen mit NPM-ALK Expression. Die STAT3/SBNO2-Achse stellt deshalb einen neuartigen Prognosefaktor dar und ist ein vielversprechendes künftiges therapeutisches Ziel bei STAT3-gesteuerten hämatopoetischen Krebserkrankungen.

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