Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023

Leishmania are responsible for visceral and (muco)cutaneous leishmaniasis in humans and animals. In view of severe side effects of approved drugs and development of resistance, new antileishmanial therapeutic approaches are needed. Leishmania exist in two forms: as flagellated extracellular promastigotes and as aflagellated intracellular amastigotes (in the phagolysosomes of mammalian macrophages). Both forms contain a single mitochondrion per cell. For the identification of direct mitochondrial drug targets, usually isolation of mitochondria is required. This is complicated by the large size and ramification of the mitochondrion and microtubule arrays adhering to the inner side of the leishmanial cell membrane. The aim of this bachelor thesis was to find out whether detergent-permeabilised (digitonin, Triton X-100) Leishmania tarentolae promastigotes (LtP) are a suitable experimental model for studying mitochondrial function. The respiratory chain was assessed in permeabilised LtP by means of a Clark-type O2 electrode. The activities of mitochondrial electron transfer complexes were determined spectrophotometrically using artificial (2,6-dichlorophenolindophenol) or natural electron acceptors (cytochrome c). O2 consumption rates and activities of mitochondrial complexes were measured in the presence of appropriate substrates (succinate, glutamate/malate, proline, pyruvate, NADH) and mitochondrial inhibitors (cyanide, antimycin A, malonate, rotenone). The highest respiratory control values were observed in digitonin-permeabilised LtP (25 μg digitonin/ml mannitol medium) consuming succinate, glutamate/malate and proline, while pyruvate and NADH did not show neither an ADP-dependent stimulation of O2 consumption nor a pronounced KCN-dependent inhibition of O2 consumption. While antimycin A (complex III inhibitor) and malonate (complex II inhibitor) have shown a significant inhibition, rotenone (complex I inhibitor) has little influence on O2 consumption rates and cytochrome c reductase activities in succinate-, glutamate/malate- and proline-consuming digitonin-permeabilised LtP. In summary, digitonin-permeabilised LtP could be a suitable model for studies on mitochondrial function avoiding the difficulties in isolation of mitochondria from Leishmania.

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023

Leishmanien sind für die viszerale und (muko)kutane Leishmaniose bei Mensch und Tier verantwortlich. Angesichts der schweren Nebenwirkungen zugelassener Medikamente und der Entwicklung von Resistenzen sind neue Therapieansätze gegen Leishmanien erforderlich. Leishmanien kommen in zwei Formen vor: als extrazelluläre Promastigoten mit Geißeln und als intrazelluläre Amastigoten ohne Geißeln (in den Phagolysosomen von Säugetiermakrophagen). Beide Formen enthalten ein einziges Mitochondrium pro Zelle. Für die Identifizierung direkter mitochondrialer Wirkstoffziele ist in der Regel die Isolierung der Mitochondrien erforderlich. In Leishmanien wird dies durch die Größe und Verzweigung des Mitochondriums und die Mikrotubuli-Arrays erschwert, welche an der Innenseite der Zellmembran haften. Ziel dieser Bachelorarbeit war es, herauszufinden, ob mit Detergenzien (Digitonin, Triton X-100) permeabilisierte Leishmania tarentolae Promastigoten (LtP) ein geeignetes experimentelles Modell zur Untersuchung der Mitochondrienfunktion darstellen. Die Atmungskette wurde in permeabilisierten LtP mit Hilfe einer Clark O2-Elektrode evaluiert. Die Aktivitäten der mitochondrialen Elektronentransfer-Komplexe wurden spektrophotometrisch mit künstlichen (2,6-Dichlorphenolindophenol) oder natürlichen Elektronenakzeptoren (Cytochrom c) bestimmt. Die O2-Verbrauchsraten und Aktivitäten der mitochondrialen Komplexe wurden in Gegenwart geeigneter Substrate (Succinat, Glutamat/Malat, Prolin, Pyruvat, NADH) und mitochondrialer Inhibitoren (Cyanid, Antimycin A, Malonat, Rotenon) gemessen. Die höchsten Atmungskontrollwerte wurden in Digitonin-permeabilisierten LtP (25 μg Digitonin/ml Mannitolmedium) beobachtet, die Succinat, Glutamat/Malat und Prolin konsumierten. Pyruvat und NADH hingegen zeigten weder eine ADP-abhängige Stimulation des O2-Verbrauchs, noch eine ausgeprägte KCN-abhängige Hemmung des O2-Verbrauchs. Während Antimycin A (Komplex-III-Inhibitor) und Malonat (Komplex-II-Inhibitor) eine signifikante Hemmung zeigten, hatte Rotenon (Komplex-I-Inhibitor) nur einen geringen Einfluss auf die O2-Verbrauchsraten und die Cytochrom-c-Reduktase-Aktivitäten in Succinat-, Glutamat/Malat- und Prolin-verbrauchenden Digitonin-permeabilisierten LtP. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Digitonin-permeabilisierte LtP ein geeignetes Modell für Studien zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion darstellen könnten, welches die Schwierigkeiten bei der Isolierung von Mitochondrien aus Leishmanien.

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