Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023

Das maligne Melanom ist eine gefährliche Form von Hautkrebs, die aus den pigmentproduzierenden Melanozyten entsteht und Tumore sowie aggressive Metastasen bildet. Beim Menschen weisen die meisten Melanome Mutationen im BRAF-Gen (BRAF V600) auf, die zu einer dauerhaften Aktivierung von Zellteilungssignalen führt. In experimentellen Studien wurde gezeigt, dass die konstitutive BRAF-Aktivierung mit einer erhöhten Expression von HO-1 assoziiert ist. Es ist daher anzunehmen, dass Melanomazellen von einer aktiven HO profitieren. Metastasierende Melanome, die eine BRAF V600 Mutation aufweisen, können mit BRAFi, wie Vemurafenib, behandelt werden, zeigen jedoch oft nach einiger Zeit eine Resistenz gegen das Medikament. Da bekannt ist, dass HO in tumorösem Gewebe vermehrt exprimiert wird und außerdem zur Metastasierung und Angiogenese von Melanomen beitragen kann, ist es möglich, dass die HO auch eine Rolle auch in der Resistenzentwicklung gegen BRAFi spielt. In anderen Tumorzellen konnte bereits gezeigt werden, dass eine HO-1 Erhöhung mit der Ausbildung der Chemoresistenz in Verbindung steht. Dabei wird vermutet, dass die Produkte, die in der HO-Reaktion gebildet werden, die Zellen gegen den oxidativen Stress und die Induktion der Apoptose schützen. Ziel der vorliegenden Diplomarbeit war es daher zu untersuchen, ob die HO-Aktivität auf die Gabe von Vemurafenib anspricht, und ob sie sich unter der Behandlung mit der Zeit verändert. Daher sollte die HO-Aktivität in Zellen der Linie BMC1-M1, die mit und ohne Vemurafenib behandelt wurden, in einer zeitlichen Kinetik erfasst werden. Es wurde vermutet, dass die HO- Aktivität der Zellen unter Einfluss von Vemurafenib zunächst gehemmt wird, sich aber im Anschluss wieder normalisiert, oder sogar ansteigt. BMC1-M1 Zellen wurden in drei Behandlungsgruppen (Kontrolle (Vehikel), Vemurafenib (10μM) und Hämin (1mM) eingeteilt, jeweils für 6h, 24h und 48h inkubiert. Die Behandlung mit Hämin wurde als Positivkontrolle mitgeführt. Für die Bestimmung der HO-Aktivität wurde ein gekoppelter biochemischer in vitro Assay eingesetzt. Dabei wurde als Maß für die HO-Aktivität die Menge an BR herangezogen, die vom Zellhomogenat in 30‘ je mg Protein gebildet wird. Zunächst wurden die experimentellen Rahmenbedingungen kontrolliert und sichergestellt, dass die im Assay entstandene BR-Menge einen direkten Rückschluss auf die zugrundeliegende HO- Aktivität erlaubt, da das durch die HO umgewandelte Hämin vollständig in BR überführt werden konnte. Dazu wurde auch das der HO nachgeschaltete Enzym, Biliverdinreduktase, auf eine ausreichend hohe Aktivität überprüft. Die BR-Menge wurde mittels Photometrie quantifiziert und die Proteinmenge in jedem Inkubations-Ansatz mit der Methode nach Bradford bestimmt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe führte die Hämin- Behandlung in allen Zeitpunkten zu einer signifikant höheren HO-Aktivität. Dies zeigt, dass HO in BMC1-M1 induziert werden kann. Die Vemurafenib-Behandlung führte demgegenüber bereits nach 6h zu einer moderaten Hemmung der HO-Aktivität (etwa 25%), welche nach 24h signifikant war. Nach 48 hatte sich die HO-Aktivität jedoch wieder normalisiert, was nahelegt, dass die Hemmung zu diesem Zeitpunkt bereits überkommen wurde. Die erhobenen Daten bestätigen somit die Hypothese, dass die Behandlung mit Vemurafenib die HO-Aktivität nur transient hemmt, und die Hemmung im Späteren überkommen werden kann. Dies könnte an einer kompensatorischen Induktion der HO1 durch den Vemurafenib-induzierten Zellstress liegen. Um diese Vermutung zu bestätigen, müssten weitere Untersuchungen z.B. zur Genexpression durchgeführt werden. Jedenfalls zeigen die erhobenen Daten, dass Vemurafenib nur kurzzeitig die Bildung der zellschützenden HO-Produkte unterdrücken kann, und diese nach länger-andauernder Behandlung mit BRAFi wieder zum Zellschutz zur Verfügung stehen. Diese Ergebnisse stellen somit eine wichtige Grundlage zur Frage der Rolle der HO-Aktivität in der Krebstherapie dar.

The malignant melanoma is a dangerous form of skin cancer that arises from pigmentproducing melanocytes and forms tumours as well as aggressive metastases. In humans, most melanomas exhibit mutations in the BRAF gene (BRAF V600), resulting in a sustained activation of cell division signals. Experimental studies have shown that constitutive BRAF activation is associated with increased expression of HO-1. It is therefore assumed that melanoma cells benefit from active HO. Metastatic melanomas harbouring a BRAF V600 mutation can be treated with BRAF inhibitors (BRAFi) such as Vemurafenib, but they often develop resistance to the medication over time. Since HO is known to be overexpressed in tumorous tissue and can contribute to the metastasis and angiogenesis of melanomas, it is possible that HO also plays a role in the development of resistance to BRAFi. In other tumour cells, an increase in HO-1 has been shown to be associated with the development of chemoresistance, with the products formed in the HO reaction believed to protect cells against oxidative stress and apoptosis induction. Therefore, the aim of this thesis was to investigate whether HO activity responds to the administration of Vemurafenib and whether it changes over time during treatment. The HO activity in BMC1-M1 cells, treated with and without Vemurafenib, was measured over a temporal kinetic period. It was hypothesized that under the influence of Vemurafenib, the HO activity of the cells would initially be inhibited but would subsequently normalize or even increase. BMC1-M1 cells were divided into three treatment groups (control (vehicle), Vemurafenib (10μM), and hemin (1mM), incubated for 6h, 24h, and 48h, and used for determining HO activity using a coupled biochemical in vitro assay. The amount of bilirubin (BR) formed by the cell homogenate per mg of protein in 30 minutes was used as a measure of HO activity. First, the experimental conditions were controlled to ensure that the amount of BR generated in the assay allowed for a direct inference of the underlying HO activity since the Hemin converted by HO is completely converted to BR. Additionally, the activity of biliverdin reductase, the enzyme downstream of HO, was checked to be sufficiently high. The amount of BR was quantified by photometry and the protein amount in each incubation assay was determined using the Bradford method. Compared to the control group, hemin treatment resulted in significantly higher HO activity at all time points, indicating that HO can be induced in BMC1-M1 cells. In contrast, Vemurafenib treatment led to a moderate inhibition of HO activity (approximately 25%) after 6 hours, which became significant after 24 hours. However, after 48 hours, HO activity normalized again, suggesting that the inhibition had been overcome by that time. Thus, the collected data confirm the hypothesis that Vemurafenib treatment only transiently inhibits HO activity, and the inhibition can be overcome later. This could be due to compensatory induction of HO1 by the Vemurafenib-induced cellular stress. Further investigations, such as gene expression studies, would be necessary to confirm this assumption. Nevertheless, the data obtained demonstrate that Vemurafenib can only temporarily suppress the formation of cell-protective HO products, which become available again for cellular protection after prolonged treatment with BRAFi. These results thus provide an important basis for the question of the role of HO activity in cancer therapy.

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