Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023

Makrophagen sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die sowohl für Entzündungsreaktionen, als auch für die Wiederherstellung der Gewebshomöostase wichtig sind. Je nach Funktion werden sie in pro-inflammatorische (M1) und anti-inflammatorische-Makrophagen (M2) unterteilt und können ihre Eigenschaften je nach umgebenden Milieu ändern. Es ist bekannt, dass erhöhte Glukosespiegel einen pro-inflammatorischen Einfluss auf Makrophagen haben. Für den bei Nahrungskarenz gebildeten Ketonkörpern beta-Hydroxybutyrat (3HB) gibt es kontroverse Ergebnisse auf die Polarisierung von Makrophagen. Mit der Polarisierung der Makrophagen ist auch das Enzym Hämoxygenase-1 (HO-1) assoziiert, welches als Marker-Enzym des M2 Phänotyps angesehen wird. Die HO degradiert Häm zu Eisen (Fe3+), Kohlenmonoxid und Biliverdin, welches durch Biliverdinreduktase zu Bilirubin (BR) umgewandelt wird. Man glaubt, dass die Hämdegradation, auch wegen ihrer Endprodukte, eine wichtige Rolle für die anti-inflammatorische Wirkung von Makrophagen hat. Der Einfluss von Energiesubstraten auf die HO-Aktivität von Makrophagen wurde bisher kaum untersucht. Das Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss von Glukose und 3HB auf die HO-Aktivität von Makrophagen herauszufinden. Makrophagen der Linie J774A.1 wurden durch die Inkubation mit moderaten (5,6 mmol/L) und erhöhten (25 mmol/L) Glukosekonzentrationen in Ab- oder Anwesenheit von 3HB (20 mmol/L) vorbehandelt. Im Anschluss wurden die Zellen mit LPS (1 μg/ml) für eine pro-inflammatorische Polarisierung oder mit Hämin (20 μmol/L) für eine anti-inflammatorische Polarisierung inkubiert. Thiocitrullin (TC, 50 μmol/L), ein NO-Synthase Hemmer, wurde eingesetzt, um den Effekt der LPS-stimulierten NO-Bildung auf die HO-Aktivität zu untersuchen. Als Maß für die HO-Aktivität wurde die Kapazität des Zellhomogenates Häm in BR umzuwandeln unter Berücksichtigung der zugrundeliegenden Proteinmenge herangezogen. Unsere Daten zeigen, dass 3HB und die erhöhte Glukosekonzentration einen hemmenden Einfluss auf die HO-Aktivität hatten. Außerdem zeigte sich, dass die Hämin-Behandlung in Anwesenheit der Energiesubstrate weniger effektiv für die Erhöhung der HO-Aktivität war. Daraus lässt sich schließen, dass die Energiesubstrate eine pro-inflammatorische Wirkung auf Makrophagen haben und die Ausprägung eines anti-inflammatorischen Phänotyps hemmen. Da eine verminderte HO-Aktivität mit einer reduzierten Häm-Beseitigung und Entzündungsprozessen assoziiert sein dürfte, könnte dies eine Erklärung für die schlechtere Wundheilung bei Diabetes sein.

Diploma thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023

Macrophages are cells of the innate immune system that are important for defence and for the restoration of tissue homeostasis. Depending on their function they are divided into pro-inflammatory (M1) and anti-inflammatory (M2) macrophages and can change their polarisation state depending on the surrounding environment. It is known that elevated glucose levels have a pro-inflammatory effect on macrophages. For beta-hydroxybutyrate (3HB), which is synthesized in the liver during food deprivation, there are controversial results on macrophage polarization. However, associated with macrophage polarization is the enzyme heme oxygenase-1 (HO-1), which is considered as a marker enzyme of the M2 phenotype. HO itself degrades heme yielding iron(Fe2+), carbon monoxide, and biliverdin, which is then converted to bilirubin (BR) by biliverdin reductase. It is believed that heme degradation has an important role on the anti-inflammatory effect of macrophages. However, the influence of energy substrates on the HO activity of macrophages has hardly been studied. The aim of this diploma thesis was to find out if glucose and 3HB have an influence on the HO activity of macrophages. Macrophages of the cell line J774A.1 were incubated with moderate (5.6 mmol/l) and increased (25 mmol/l) glucose concentrations in the absence or presence of 3HB (20 mmol/l). Subsequently, cells were incubated with LPS (1 μg/ml) for pro-inflammatory polarization or with hemin (20 μmol/l) for anti-inflammatory polarization. Thiocitrulline (TC, 50 μmol/l), an NO synthase inhibitor was used to study the effect of LPS-stimulated NO formation on HO activity. To measure the HO-activity, the capacity of the cell homogenate to convert heme to bilirubin was quantified photometrically via a coupled biochemical assay. The amount of protein present per well at the end of the incubation period was determined using the Bradford method and used for normalization. Our data show that 3HB, and an increased glucose concentration had an inhibitory effect on HO activity. It also showed that the hemin treatment was less effective to increase the HO activity in the presence of the energy substrates. This suggests that the energy substrates have a pro-inflammatory effect on macrophages in addition to inhibiting the expression of an anti-inflammatory phenotype. Since decreased HO activity is likely to be associated with reduced heme removal and persistent inflammatory processes, this could explain the poorer wound healing in diabetes.

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36 Blätter