Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020

Listeria (L.) monocytogenes is a food-borne pathogen and responsible for the infection disease listeriosis, which can be fatal for elderly people, immunocompromised, newborn and unborn individuals. The main foods implicated in listeriosis cases are milk, unpasteurized soft cheeses, ready-to-eat prepared meats, undercooked poultry and fish, unwashed raw vegetables and fruits. L. monocytogenes can perfectly survive in the food processing environment leading to food contamination. However, beside L. monocytogenes many bacteria are present in the food producing environment including the food spoilers Lactococcus piscium, Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens and Acinetobacter harbinensis, too. Bacteria have developed different strategies to reduce the growth of the other competitors like the toxin-antitoxin systems. The RHS protein is part of such a toxin-antitoxin system and its role in bacterial competition has been shown for species like Dickeya dadantii, but not yet for L. monocytogenes. RHS proteins are mainly harboured by L. monocytogenes strains of sequence type 121, a sequence type predominately found in the food processing environment. The aim of this bachelor thesis was to determine the conditions under which the RHS protein of L. monocytogenes is expressed. Therefore a strain with an eGFP-tagged promotor of the rhs operon was created, so that the expression of RHS could be measured as a fluorescence signal in co-cultivation experiments. First the optimal parameters for the experiment had to be determined. Different cultivation media were tested for growth of the target strains and their autofluorescence. This revealed that RPMI, a cell culture medium, is the most suitable medium. To reduce background fluorescence RPMI without phenol red was finally chosen as medium for the experiments. Measurement of fluorescence was performed at various time points, revealing that the signal is most stable after 24 hours growth of the bacterial cultures. L. monocytogenes 6179 harbouring the plasmid pIMK2(eGFP) was used as positive control, because it is meant to overexpress eGFP. However, first experiments showed that the fluorescence signal of L. monocytogenes + pIMK2(eGFP) is not significantly higher than the signal of L. monocytogenes 6179 WT. Therefore a L. monocytogenes strain expressing eGFP chromosomally will be created, as the expression of chromosomal genes is more stable than the expression of genes on plasmids. The vector pPL2 was used for cloning and introduced into competent L. monocytogenes, via electroporation. Positive transformants were selected on TSA plates supplemented with chloramphenicol and a control PCR and gel electrophoresis was performed to verify the transformation. This revealed that the transformation wasn’t successful and pPL2 didn’t integrate. Cloning will be repeated as a functional positive control is essential for all subsequent experiments.

Listeria (L.) monozytogenes ist ein lebensmittelbedingtes Pathogen und verursacht die Krankheit Listeriose, die für ältere, immunkomprimierte, neugeborene und ungeborene Menschen tödlich enden kann. Listeriosefälle werden mit diätetische Risikofaktoren assoziiert und häufig betroffene Lebensmittel sind Milch, nicht-pasteurisierter Weichkäse, ready-to-eat Fleisch, nicht gares Geflügel und Fisch, sowie rohes Gemüse und Obst. Aber L. monozytogenes ist nicht das einzige Bakterium, das man in der Lebensmittelverarbeitung finden kann, und so tauchen auch die Lebensmittelverderber Lactococcus piscium, Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens und Acinetobacter harbinensis auf. Um mit anderen Bakterien zu konkurrieren gibt es verschiedene Strategien das Wachstum der Konkurrenten zu reduzieren, wie etwa Toxin-Antitoxin Systeme. Das RHS Protein ist auch Teil eines solchen Systems und seine Rolle bei der bakteriellen Konkurrenz konnte schon für Dickeya dadantii, aber noch nicht für L. monozytogenes gezeigt werden. In L. monozytogens zeigte sich, dass vor allem ein spezifischer Sequenztyp ST121, welcher häufig im Lebensmittelumfeld vorkommt, die RHS Proteine besitzt. Das Ziel dieser Bachelorarbeit war herauszufinden unter welchen Bedingungen das RHS Protein von L. monozytogenes exprimiert wird. Dafür wurde ein Stamm mit eGFP-markiertem Promotor des rhs Operons geschaffen um die Expression von RHS als Fluoreszenzsignal bei Co-Kultivierungsexperimenten messen zu können. Am Anfang mussten die optimalen Bedingungen für die Experimente bestimmt werden. Verschiedene Nährmedien wurden auf Wachstum der Zielstämme und Autofluoreszenz getestet. Das ergab, dass RPMI, ein Zellkulturmedium, am besten geeignet ist. Um die Hintergrundfluoreszenz weiter zu reduzieren wurde RPMI ohne Phenolrot für die Experimente ausgewählt. Fluoreszenzmessungen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gemacht und dabei stellte sich heraus, dass das Signal nach 24 Stunden Wachstum der Bakterienkulturen am stabilsten ist. L. monozytogenes 6179, welches das Plasmid pIMK2(eGFP) enthält, wurde als Positivkontrolle verwendet, da es eGFP überexprimieren sollte. Erste Experimente haben aber gezeigt, dass das Fluoreszenzsignal von L. monozytogenes + pIMK2(eGFP) nicht signifikant höher ist als das von L. monozytogenes 6179 Wildtyp. Daher planen wir einen L. monozytogenes Stamm zu erzeugen, der eGFP chromosomal exprimiert, da die Expression von chromosomalen Genen stabiler ist als die von Genen auf einem Plasmid. Zum Klonieren wurde der Vektor pPL2 verwendet und in kompetenten L. monozytogenes elektroporiert. Positive Transformaten wurden auf TSA-Platten mit Chloramphenicol selektiert. Eine Kontroll-PCR mit anschließender Gelelektrophorese wurde durchgeführt, um die Transformation zu bestätigen. Dabei stellte sich heraus, dass die Transformation nicht erfolgreich war und sich pPL2 somit nicht integriert hatte. Das Klonieren wird wiederholt, da eine gut funktionierende Positivkontrolle für alle weiteren Versuche entscheidend ist.

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