Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023

Der schwarze Hautkrebs (Melanom) zählt zu den gefährlichsten Krebsformen beim Menschen. Die Hälfte der Patient*innen zeigen eine Mutation am Codon 600 der Serin/Threonin Kinase B-RAF (BRAFV600), welche u.a. für die Regulation der Zellteilung zuständig ist. Durch die Therapie mit einem BRAF-Kinase-Inhibitor, wie z.B. Dabrafenib, kann ein fortschreitendes Wachstum unterbunden werden, jedoch kommt es bei vielen Fällen innerhalb eines Jahres zu Rezidiven, welche gegen den Inhibitor resistent sind. Um die Resistenzentwicklung zu unterdrücken, müssten bei einer initialen Behandlung möglichst viele Tumorzellen beseitigt werden. Daher wird eine Kombinations-Therapie eines BRAF-Kinase-Inhibitors mit Wirkstoffen, welche andere Signalwege beeinflussen, vorgeschlagen. Ein vielversprechender Ansatz ist die Einleitung der Ferroptose, einer Eisen-abhängigen Form des programmierten Zelltods. Da resistente Melanome oft erhöhte Spiegel der induzierbaren Form der Hämoxygenase (HO-1) zeigen, welche Häm unter Eisen-Freisetzung abbaut, war das Ziel dieser Arbeit, herauszufinden, ob die HO-1 Induktion zur gezielten Eliminierung von Melanomzellen durch Ferroptose in Kombination mit Dabrafenib genutzt werden kann. Bereits bekannte Melanomzelllinien wurden zunächst allein mit dem Ferroptose-Induktor RASselective lethal 3 oder einem Endoperoxid Artemisinin zur Ermittlung der wirksamen Konzentration (mittlere inhibitorischen Konzentration, IC50) auf die Zelldichte (IncuCyte®) behandelt. Dabei dienten Hämin, ein HO-Induktor, Zink-Protoporphyrin, ein HO-Hemmer, der Eisenchelator Deferoxamin und die externe Eisenquelle Eisen-Ammoniumcitrat als Kontrollsubstanzen. Nach der Inkubation wurde das Endprodukt des Hämabbaus, Bilirubin, aus dem Zellkulturüberstand extrahiert und quantifiziert. Als Maß für die HO-Aktivität wurde die erhaltene Bilirubin-Menge auf die zugrundeliegende Zelldichte normalisiert. Die wirksamen Konzentrationen wurden dann in Kombinationsversuchen mit Dabrafenib getestet. Unsere Daten zeigen, dass die Kombination von Dabrafenib mit RAS-selective lethal 3 zu einer höheren Zellreduktion führt, als durch die Einzelsubstanzen allein. Möglicherweise wurde also das Eisen aus der HO-Aktivität für die Induktion der Ferroptose genutzt. Jedoch wurden keine synergistischen Effekte erzielt und einige Zellen überlebten die Behandlung. Daher sind weitere Versuche mit anderen Wirkstoffen bzw. Kombinationen notwendig, um die Zellteilung nachhaltiger zu reduzieren, ohne zu einer Resistenzentwicklung beizutragen.

Black skin cancer (melanoma) is one of the most dangerous forms of cancer in humans. Half of the patients show a mutation at codon 600 of the serine/threonine kinase B-RAF (BRAFV600), which is responsible for the regulation of cell division. The therapy with a BRAF kinase inhibitor, such as dabrafenib, can prevent progressive growth, but many cases develop recurrences within a year, which are resistant to the inhibitor. In order to suppress the development of resistance, most cancer cells should be eliminated in an initial treatment. Therefore, a combination therapy of a BRAF kinase inhibitor with agents that influence other signaling pathways is proposed. One approach is the induction of ferroptosis, an iron-dependent form of programmed cell death. Resistant melanomas often show elevated levels of the inducible form of haem oxygenase (HO-1), which degrades haem with iron release, so the aim of this work was to find out if HO-1 induction can be used to eliminate melanoma cells by ferroptosis in combination with dabrafenib. Known melanoma cell lines were first treated alone with the ferroptosis inductor RAS-selective lethal 3 or the endoperoxide artemisinin to determine the effective concentration (mean inhibitory concentration, IC50) on cell density (IncuCyte®). Haemin, an HO inducer, zinc protoporphyrin, an HO inhibitor, the iron chelator deferoxamine and the external iron source iron ammonium citrate are used as control substances. After incubation, the end product of haem degradation, bilirubin, was extracted from the cell culture supernatant and quantified. To represent the HO activity, the amount of bilirubin was normalised to the cell density. Then the effective concentrations were tested in combination with dabrafenib. Our data show that the combination of dabrafenib with RASselective lethal 3 leads to a higher cell reduction than by the single substances. It is possible that the iron from the HO activity was used for the induction of ferroptosis. However, no synergistic effects were obtained with the combination and some cells survived the treatment. Therefore, further trials with other agents or combinations are necessary to reduce cell division more sustainably without contributing to the development of resistance.

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