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Das Ziel dieser Studie war es, eine reproduzierbare Methode zu entwickeln, um canine Hornhautzellen, und hier vor allem Epithelzellen, zuverlässig kultivieren und isolieren zu können. Mittels Versuch und Irrtum wurden unterschiedliche Methoden angewandt und aussortiert. Die gewonnenen Zellen wurden dann weiterverwendet, um Verträglichkeitsstudien mit verdünnter PVI Lösung durchzuführen und zu eruieren, welche Konzentrationen und Einwirkungsdauern am sinnvollsten sind. Es wurden Hornhäute von Hunden (n = 11) verwendet, die aus Gründen, die nicht mit dieser Studie in Verbindung stehen, euthanasiert wurden. Unter sterilen Bedingungen wurden diese Hornhäute enzymatisch verdaut und Explants ausgestanzt. Die epithelialen und stromalen Explants wurden dann in Kulturplatten gelegt und es wurde beobachtet ob und wie gut die gewünschten Zellen auswachsen. Einzig die Verwendung von Stanzen mit einem Durchmesser von 4mm und 48-well Kulturplatten hat dazu geführt, dass canine Hornhautepithelzellen auswachsen und weiterverwendet werden können. Dies war nur bei Hornhäuten von Hunden möglich, die jünger als vier Jahre waren. Es waren bis zu 4 Passagen mit einer Zelldichte von 1–2 x 104 Zellen/cm2 möglich, nachdem die Zellen für acht Minuten mit Trypsin abgelöst wurden. Die Kultivierung und Passage von caninen Hornhautstromazellen war mit allen Explantgrößen (außer 2mm) und jeder Hornhaut möglich. Anschließend wurden diese Zellen verwendet, um deren Viabilität und Migrationsfähigkeit zu untersuchen, nachdem sie mit verdünntem PVI in verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen Einwirkungsdauern versetzt wurden. Die Viabilität der Zellen wurde mit einem Lumineszenzsignal, 0, 24, 48 und 72 Stunden nachdem sie mit PVI inkubiert wurden, gemessen. Statistisch signifikante Unterschiede zeigten sich bei der verwendeten Substanz (Kontrolle = PBS versus 1, 2 und 5%iges PVI; p = 0.000), Einwirkungsdauer (eine, drei oder zehn Minuten; p = 0.005) und Zellart (korneale Epithel- oder Stromazellen; p = 0.000). Die Epithelzellen waren generell empfindlicher als die Stromazellen. Unabhängig von der Einwirkungsdauer erholten sich keine der Zellen, nachdem sie mit 5% PVI versetzt wurden. Ebenso erholten sich, unabhängig von der Konzentration, keine der Zellen nach einer Einwirkungsdauer von zehn Minuten. Bei einer Einwirkungsdauer von einer Minute und 1 % PVI erholten sich alle Zellen gut. Das Migrationsverhalten wurde mit einem Scratch Assay ermittelt, bei dem innerhalb von 72 Stunden gemessen wird, wie schnell sich die zuvor kreierte, zellfreie Fläche schließt. Auch hier erholten sich die Stromazellen insgesamt besser als die Epithelzellen. Die Migrationskapazität nahm zeit- und konzentrationsabhängig ab und war am besten bei 1 % PVI und einer Minute Einwirkungsdauer und am schlechtesten bei 5 % PVI und zehn Minuten Einwirkungsdauer. Diese Ergebnisse dienen als Grundlage für weitere Studien, anhand derer, zusätzlich zu den höchstmöglichen tolerierbaren Konzentrationen und Einwirkungsdauern, die antimikrobiellen Eigenschaften ermittelt werden können. Zusammen würde dies zu einem optimierten präoperativen Antisepsis Protokoll führen, welches idealerweise standardmäßig eingesetzt werden kann.

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The aims of the present study were to develop a reliable and reproducible method to cultivate and isolate canine corneal epithelial and stromal cell in-vitro. By trial and error several methods were applied and altered. These cultivated cells were then used to describe and compare the effects of topically applied 1, 2, or 5 % PVI for one, three, and ten minutes on corneal cell migration and viability. Corneas of 11 dogs, euthanized for reasons unrelated to this study were used. Under sterile conditions, corneas were enzymatically digested, and explants were obtained using biopsy punches. Epithelial and stromal explants were separately taken into cell culture and outgrowth was observed. Solely the incubation of 4mm diameter corneal epithelial explants in a 48-well culture plate in full medium led to sufficient growth of canine corneal epithelial cells. Only corneas of dogs younger than four years showed epithelial cell outgrowth. Up to four passages were possible with a cell density of 10 000–20 000 cells per square centimeter, after dissociation in trypsin for 8 minutes. Cell detachment and passaging for stromal cells was possible with every cornea and with every explant, except for those 2 mm sized ones. Subsequently cell viability and migration were evaluated after incubation for one, three, or ten minutes with 1, 2, or 5 % PVI. Viability was measured as luminescence signals at 0, 24, 48, and 72 hours after exposure to PVI in aforementioned concentrations. Statistically significant differences for substance used (control = PBS vs. 1, 2, and 5 % PVI; p = 0.000), exposure time (one, three or ten minutes; p = 0.005) and cell type (cCECs or cCSCs; p = 0.000) were noted. Epithelial cells were generally less resistant than stromal cells. In concentrations as high as 5% (regardless to exposure time) and after ten minutes exposure time (regardless to PVI concentration), none of the cells recovered. With a PVI concentration as low as 1 % and an exposure time of one minute, all cells recovered well. The migration capacity was evaluated by a scratch assay and the closure of the beforehand created cell free area was monitored over 72 hours. Again, stromal cells recovered better and epithelial cells. Cell migration capacity decreased in a dose- and time-dependent manner, being best with 1 % PVI at a one minute exposure time and worst with 5 % PVI and a ten minute exposure time. Results of this study serve as basis for further studies to specify the antimicrobial effects additionally to the highest tolerated concentrations and exposure times. Altogether, this could result in an optimized preoperative antisepsis protocol, with the lowest cytotoxicity and highest antimicrobial effect.

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