Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2022

At least 95 % of mugwort allergic patients are sensitized against the major mugwort pollen allergen Art v 1, making it an interesting candidate for new treatments based on Allergenspecific immunotherapy (AIT). Hypoallergenic virus-like nanoparticles (VNP) encasing altered peptide ligands (APL) of Art v 1 and surface expressing murine IL-15 (mIL-15) are therefore being examined as a new approach to safely perform AIT. The APLs can cause differential Tcell receptor signals and surface-expressed mIL-15 also induces a shift towards Th1 cytokine production. HEK293T cells were transfected with three different plasmids, pMD-OGP (containing a gag-pol sequence of Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV)), pk12- MA::Art v 1 (Art v 1 fused to the MoMLV matrix protein, MAp15) and pk12-mIL-15-GPI (mIL- 15 with a GPI-anchor attachment sequence, for additional Th1 priming) for VNP production. The proper cellular expression was checked with flow cytometric staining on transiently transfected HEK293T cells. The obtained VNPs were purified with successive rounds of ultracentrifugation washing steps. With the BCA protein assay, the total protein content of the VNPs and with a double-sandwich ELISA, the percentage of Art v 1 inside the VNPs were quantified in relation to the WT + mIL-15 VNP. Further biochemical characterization of the VNPs was performed through Western Blot with SDS-PAGE. The hypoallergenicity of the VNP preparation was tested using Art v 1-specific-IgE sensitized rat basophil leukemia cells as the readout. The VNPs shielded full-length his-tagged APLs of Art v 1 and expressed mIL-15 on their surface. The hypoallergenicity of some VNPs, the proper expression of the plasmids and the size of recombinant proteins were confirmed. In conclusion, the VNPs shielding the fulllength his-tagged APLs of Art v 1 and expressing mIL-15 on their surface, were successfully produced and biochemically characterized. These new platforms can now be studied in vitro and in vivo for their immunomodulatory effects on allergen-specific Th cytokine production.

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2022

Mindestens 95 % der Beifusallergiker sind gegen das Hauptallergen des Beifuspollen, Art v 1, sensibilisiert, was es zu einem interessanten Kandidaten für neue Behandlungen im Rahmen allergenspezifischer Immuntherapie (AIT) macht. Hypoallergene Virus ähnliche Nanopartikel (VNP), die modifizierte Peptidliganden (APL) von Art v 1 beinhalten und murines IL-15 (mIL- 15) auf der Oberflache exprimieren, werden in diesem Zusammenhang als neuer Ansatz für eine sichere Durchführung von AIT als Therapie oder Prävention der Beifusallergie untersucht. Die APL können unterschiedliche T-Zell-Rezeptor-Signale stimulieren und Oberflächenexprimiertes mIL-15 induziert einen Wechsel zur Produktion von Th1-Zytokinen. Für die VNPProduktion wurden HEK293T-Zellen mit drei verschiedenen Plasmiden transfiziert: pMD-OGP (enthalt die gag-pol-Sequenz des Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV)), pk12- MA::Art v 1 (Art v 1 fusioniert mit dem MoMLV-Matrixprotein, MAp15) und pk12-mIL-15-GPI (mIL-15 mit einer GPI-Verankerungssequenz für zusätzliches Th1-Priming). Die zellulare Expression wurde mit Immunhistochemie und Durchflusszytometrie in vorübergehend transfizierten HEK293T-Zellen überprüft. Die erhaltenen VNPs wurden durch wiederholte Runden Ultrazentrifugation aufgereinigt. Mit dem BCA-Protein-Assay wurde der Gesamtproteingehalt der VNPs und mit einem “double-sandwich“ ELISA der Prozentsatz an Art v 1 in den VNPs in Relation zu den WT + mIL-15 VNP quantifiziert. Außerdem wurde ein Western Blot mit SDS-PAGE als weitere biochemische Charakterisierung der VNPs durchgeführt. Die Allergenität der VNP-Präparate wurde mit Art v 1-spezifischen IgE sensibilisierten Ratten-Basophilen-Leukämiezellen getestet. Die VNP beinhalteten die APL des His-markierten Art v 1 und exprimierten mIL-15 auf ihrer Oberflache. Die Hypoallergenität einiger VNP sowie die korrekte Expression der Plasmide und Größe der rekombinanten Proteine wurde bestätigt. Zusammenfassend lasst sich sagen, dass VNPs, welche Art v 1 in voller Länge beinhalten und mIL-15 auf ihrer Oberflache exprimieren, erfolgreich hergestellt und biochemisch charakterisiert wurden. Diese neuen Plattformen können nun in vitro und in vivo auf ihre immunmodulatorische Wirkung auf die allergenspezifische Th-Zytokin-Produktion untersucht werden.

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