Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2022

Mycoplasma agalactiae causes contagious agalactia in small ruminants. Symptoms of this disease include mastitis, arthritis, conjunctivitis, septicaemia and sporadic genital infections. The molecular basis for pathogenicity has yet to be elucidated, however, the variable proteins of M. agalactiae (Vpma) multigene family seem to play a role in adhesion and immune evasion via antigenic variation. Vpmas are surface-lipoproteins, similar to the variable surface proteins (Vsa) of Mycoplasma pulmonis, where longer Vsa proteins have been shown to protect against complement. Since the ability to evade complement in serum is an important factor in systemic spread, the role of Vpmas in the differential pathogenicity of strains and mutants needs to be investigated. Bactericidal assays in sera were carried out with (i) M. agalactiae type strain PG2, which exhibits high-frequency phase variation of all six Vpma lipoproteins, (ii) strain GM139, which shows a unique Vpma profile expressing just VpmaV and (iii) six different Vpma phase-locked mutants (PLMs) expressing single stable Vpma products. After incubation with active or heat-inactivated PG2-sensitized sheep serum, serial dilutions and plating, the resulting number of colony-forming units was assessed to calculate the percentage survival. Guinea pig complement was tested using the same methodology. Additionally, western blot analyses of Triton X-114 phase extracts of PG2 and GM139 were carried out using VpmaV-specific polyclonal rabbit antibodies (α-VpmaV) and PG2-sensitized sheep serum, revealing stark differences in the profiles of the two strains. Overall data demonstrate the PG2 strain to be more susceptible to sheep serum compared to the GM139 strain bearing a different Vpma profile. Significant differences were also observed between the different PLMs, with PLMU and PLMX showing the highest serum susceptibility in serum. The results are in good correlation with previous studies where shorter lipoprotein variants were more susceptible to complement. Since none of the strains and PLMs showed susceptibility in non-sensitized sheep serum in previous studies, antibodies seem to play an important role in serum killing. Proteins of GM139 in the gel band identified by polyclonal α-VpmaV antibodies were digested with trypsin or trypsin/Lys-C mix and peptides analysed by nano-LC-Orbitrap-MS/MS. Database search revealed that the GM139 proteins displayed high sequence coverages of different Vpmas of various M. agalactiae strains. The originally expected VpmaV however, could not be found. In conclusion, Vpmas might play an important factor in M. agalactiae's serum sensitivity and their antigenic variation likely allows the pathogen to select for variants that increase its serum resistance during systemic infections.

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2022

Mycoplasma agalactiae verursacht bei kleinen Wiederkäuern die ansteckende Agalaktie. Symptome dieser Krankheit sind Mastitis, Arthritis und Konjunktivitis. Die molekularen Grundlagen für die Pathogenität müssen noch aufgeklärt werden, jedoch scheinen die Variablen Proteine der Multigenfamilie von M. agalactiae (Vpma) eine Rolle bei der Adhäsion und Immunevasion durch Antigenvariation zu spielen. Vpmas sind Oberflächenlipoproteine, ähnlich den Variablen Oberflächenproteinen (Vsa) von Mycoplasma pulmonis, bei denen längere Vsa-Proteine nachweislich vor Komplement schützen. Da die Fähigkeit, Komplement im Serum zu umgehen, ein wichtiger Faktor bei der systemischen Ausbreitung ist, wird die Rolle von Vpmas bei der differentiellen Pathogenität von Stämmen und Mutanten untersucht. Bakterizide Assays in Seren wurden mit (i) dem M. agalactiae-Stamm PG2 durchgeführt, der eine hochfrequente Phasenvariation aller sechs Vpma-Lipoproteine aufweist, (ii) dem Stamm GM139, der nur VpmaV exprimiert, und (iii) sechs verschiedenen Vpma-Phase-Locked-Mutanten (PLMs), die einzelne Vpma-Produkte stabil exprimieren. Nach der Inkubation mit PG2-sensibilisiertem Schafserum wurden serielle Verdünnungen plattiert und die resultierende Anzahl koloniebildender Einheiten im Vergleich zu den hitzeinaktivierten Serumkontrollen bewertet, um das prozentuelle Überleben zu berechnen. Meerschweinchen-Komplement wurde ebenfalls mit der gleichen Methodik getestet. Zusätzlich wurden Western-Blot-Analysen von Triton X-114-Extrakten aus PG2 und GM139 unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen Antikörpern α-VpmaV und PG2-sensibilisiertem Schafserum durchgeführt, wodurch starke Unterschiede in den Profilen der Stämme aufgezeigt wurden. Die Gesamtdaten zeigen, dass der PG2-Stamm im Vergleich zum GM139-Stamm, der ein anderes Vpma-Profil trägt, anfälliger für Schafserum ist. Signifikante Unterschiede wurden auch zwischen den PLMs beobachtet, wobei PLMU und PLMX die höchste Serumempfindlichkeit aufwiesen. Da die Stämme und PLMs in früheren Experimenten keine Anfälligkeit in nicht sensibilisiertem Schafserum zeigten, scheinen Antikörper eine wichtige Rolle bei der Serumabtötung zu spielen. Proteine von GM139 in der mit polyklonalen α-VpmaV Antikörpern identifizierten Gelbande wurden mit Nano-LC-Orbitrap-MS/MS analysiert. Die Datenbanksuche ergab hohe Sequenzabdeckungen von Vpmas verschiedener M. agalactiae Stämme. Das ursprünglich erwartete VpmaV konnte jedoch nicht gefunden werden. Zusammenfassend könnten Vpmas eine wichtige Rolle bei der Serumempfindlichkeit von M. agalactiae spielen, und die Antigen-Variation ermöglicht es dem Erreger wahrscheinlich, nach Varianten zu selektieren, die die Serumresistenz während systemischer Infektionen erhöhen.

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