Diploma thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2019

Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2019

The aim of the present work was the development of an in situ hybridization (ISH) and an immunohistochemistry (IHC). An oligonucleotide probe was developed using the GenBank database to perform an ISH. It was tested with different protocols, in paraffin sections and frozen sections, in tissues infected with avian reoviruses (ARV) and cell pellets with different probe concentrations. However, no specific signal could be detected. Furthermore, an RNA probe was developed. However, no specific signal could be generated here either. For all probes, a dot blot was also carried out in which ARV was UV linked to a positively charged membrane. Also here the probes could not bind. To develop an IHC, polyclonal antibodies were produced in rabbits. The rabbits were immunised with different ARV strains. Antibodies against ARV could be detected in the sera of the rabbits by a serum neutralization test, but the titre concentrations were low. In addition, antibodies against ARV produced in chickens were used for IHC. By IHC no specific signals could be detected in ARV infected pellets at different concentrations of the sera, on paraffin or frozen sections. The disfunction of ISH and IHC protocols are manifold and difficult to identify. However, an important factor for the failure of the methods described in the present work are most probably the low virus content in tissues and pellets.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer In situ Hybridisierung (ISH) und einer Immunhistochemie (IHC). Zur Durchführung einer ISH wurden Oligonukleotidsonden mithilfe der GenBankÒ Datenbank entwickelt. Sie wurde mit verschiedenen Protokollen, auf Paraffinschnitten und Gefrierschnitten, in mit aviären Reoviren (ARV) infizierten Geweben und Zellpellets mit unterschiedlichen Sondenkonzentrationen getestet. Dabei konnte jedoch kein spezifisches Signal detektiert werden. Weiters wurde eine RNA-Sonde entwickelt. Jedoch konnte auch hier kein spezifisches Signal in Zielzellen erzeugt werden. Für alle Sonden wurde auch ein Dot Blot durchgeführt, bei dem ARV auf einer positiv geladenen Membran UV-verlinkt wurden, was ebenfalls zu keiner Bindungsreaktion führte. Zur Entwicklung einer IHC wurden polyklonale Antikörper in Kaninchen produziert. Die Kaninchen wurden dazu mit verschiedenen ARV Stämmen infiziert. Es konnten in den Seren der Kaninchen Antikörper gegen ARV mittels Serumneutralisationstest nachgewiesen werden, jedoch waren die Titerkonzentrationen gering. Zusätzlich wurden noch Antikörper gegen ARV, die in Hühnern produziert wurden, mittels IHC getestet. Bei der Durchführung der IHC konnten bei verschiedenen Konzentrationen der Seren, auf Paraffin- oder Gefrierschnitten keine spezifischen Signale in mit ARV infizierten Pellets nachgewiesen werden. Die Ursachen für das Nichtfunktionieren der ISH und der IHC sind vielfältig zu identifizieren. Relevante Fehlerquellen bei den beschriebenen Verfahren sind jedoch niedrige Virustiter in Gewebe und Pellet.

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50 Seiten