Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020

The inhibitor of growth, family member 3 (ING3) acts as an epigenetic reader and, through physical interactions with histone modifying enzymes and subsequent chromatin remodelling processes, is involved in various cellular functions, such as cell cycle control, cell growth and apoptosis. Although ING3 has been assigned a tumour suppressor candidate status in many types of cancers, its role in the initiation and progression of prostate cancer remains to be elucidated. The aim of this thesis was to establish a murine prostate-specific and ubiquitous Ing3 knockout model based on Cre-mediated excision of a loxP flanked critical exon and assess the recombination efficiency in the prostatic glands at the DNA and protein level. Paternal inheritance of the PB-Cre4 construct was used to generate the prostate-specific Ing3 knockout, while for the generation of the ubiquitous knockout, a female mouse harbouring the PB-Cre4 transgene was utilised as a global deleter. A duplex probe-based digital PCR assay capable of counting undisrupted Ing3 copies was designed, and the impact of DNA recombination on the protein level was investigated by immunohistochemical staining for ING3 in prostate tissue samples. Consistent with a recent study, no homozygous ubiquitous Ing3 knockout mice were born, unless ING3 expression was restored by breeding with a transgenic mouse bearing the CAG-Ing3-P2A-eGFP construct. In the prostate-specific knockout, digital PCR analysis revealed mosaic gene deletion. Similar recombination efficiencies in the anterior, ventral and dorsolateral prostate lobes at approximately 25% in epithelial and mesenchymal cells together were achieved. ING3 staining in the anterior and dorsolateral prostate was very faint, and no differences in signal intensity between a knockout specimen and wildtype control were detected. Upon dissection, no animal displayed gross anatomical abnormalities that I could link to prostate cancer development. This thesis provides evidence that Ing3 behaves differently from classical tumour suppressors, like Pten, where invasive adenocarcinoma is observed in a comparable Cre-dependent knockout model. Furthermore, I confirmed the embryonic lethal phenotype of the Ing3 depleted homozygous mice. While digital PCR is a versatile, convenient and highly accurate tool for the detection and absolute quantification of the genetic alterations in this model, recombination efficiency assessment based on immunohistochemistry was not feasible due to a poor signal-to-noise ratio.

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020

Das „Inhibitor of Growth 3“ (ING3)-Gen codiert für ein Protein, welches spezifische epigenetische Markierungen erkennt und über Interaktionen mit Histon-modifizierenden Enzymen dynamische Veränderungen der Chromatinstruktur vermittelt. Es beeinflusst zahlreiche biologische Prozesse, wie Zellwachstum, Zellzykluskontrolle und Apoptose. ING3 fungiert in mehreren Krebsarten als Tumorsuppressorgen-Kandidat, allerdings ist seine Rolle in der Entwicklung des Prostatakarzinoms weitgehend unerforscht. Ziel der Arbeit war die Etablierung einer auf dem Cre-loxP-Rekombinationssystem beruhenden prostataspezifischen und ubiquitären Ing3-Knockout-Mauslinie. Darüber hinaus sollte in der gewebsspezifischen Linie die Rekombinationseffizienz auf DNA- und Proteinebene untersucht werden. Für die Generierung des ubiquitären Knockouts wurde ein weiblicher Träger des PB-Cre4 Transgens als „Cre-deleter“ herangezogen. Paternale Vererbung des PB-Cre4 Konstruktes diente der Erzeugung des prostataspezifischen Knockouts. Eine sondenbasierte duplex-digitale PCR, welche die absolute Quantifizierung funktionaler Ing3-Kopien erlaubt, wurde konzipiert. Zusätzlich wurde mittels Immunhistochemie die Verteilung von ING3 in Prostataschnitten untersucht. Im Einklang mit einer kürzlich veröffentlichten Studie war die homozygote Ing3-Deletion im Embryonalstadium letal und ein lebensfähiger Phänotyp konnte nur durch Verpaarung mit der CAG-Ing3-P2A-eGFP-Linie gezüchtet werden. In der prostataspezifischen Knockout-Linie zeigte die digitale PCR den Erfolg der unvollständigen genetischen Rekombination und den daraus resultierenden Mosaizismus. Die Rekombinationseffizienzen zwischen den anterioren, dorsolateralen und ventralen Prostatalappen unterschieden sich nicht. Die immunhistochemische Färbung von ING3 in der anterioren und dorsolateralen Prostata war schwach, zudem konnten keine Unterschiede in der Signalintensität zwischen einer Knockout-Maus und einer Wildtyp-Kontrolle detektiert werden. Bei der Tiersektion wurden keine makroskopischen Hinweise auf eine Entartung der Prostata gefunden. Diese Arbeit bestätigt den embryonal letalen Phänotyp der homozygoten Ing3-Knockout-Maus. Darüber hinaus wurde die Annahme gestärkt, wonach sich Ing3 nicht im Sinne eines klassischen Tumorsuppressors, wie beispielsweise Pten, verhält. Die digitale PCR erwies sich als vielseitige, zweckdienliche und hochakkurate Methode für die Evaluierung der genetischen Veränderung in dem beschriebenen Tiermodell. Dagegen ließ die Immunhistochemie keine zufriedenstellenden Schlüsse auf die Rekombinationseffizienz zu.

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36 Blätter