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Molecular characterization of CD4 homologue in Brown Trout (Salmo trutta)
Hassan Ashfaq
Mansour El-Matbouli
Armin Saalmüller
Hatem Soliman
Dissertation - University of Veterinary Medicine Vienna - 2021
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Since the advent of new infectious diseases, which pose, a huge financial threat to the fish aquaculture industry, the research on fish health issues has been substantial during the last decade. The Immunological aspect is in particularly being considered as one of the vital derivatives in understanding the disease advancement. This study was designed to first characterize and then investigate the facilitating functions of brown trout T-cell marker; CD4, in protectiveness against the Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV) after production of polyclonal antibodies to screen CD4+ cells in some of the cellular functional studies. Moreover, expression assays were also included to have a bigger picture of the immune response in brown trout against the virus. There were three genes CD4-1, CD4-2a, and CD4- 2b, cloned and characterized in brown Trout. The first cDNA of CD4-1 contained four immunoglobulin superfamily-like domains and was 1473 nucleotides long, with an open reading frame (ORF) encoding 490 amino acids. The CD4-2 gene appeared to be duplicated and the variants are named CD4-2a and CD4-2b that were 945 and 999 nucleotides long with 2 immunoglobulin superfamily-like domains and containing ORFs with 313 and 331 amino acids, respectively. All CD4 genes of brown trout demonstrated comparable characteristics with mammalian CD4: containing extracellular immunoglobulin-like domains as well as cytoplasmic domains (Lck), tyrosine-based activation motifs. In spite the sequence identities to mammals were low (13- 15%) they are homologous to mammalian CD4, this is also true for other published salmonids sequences. The translated brown trout CD4-1 protein sequence has a 95% and 89% identity with Atlantic salmon and rainbow trout, respectively. While CD4-2a and CD4-2b protein sequences share 84% and 97.7% identity with rainbow trout and Atlantic salmon, respectively. The basal expression levels of CD4-genes were studied and found to be highest in the thymus followed by the head kidney and spleen. However, comparably lower expression of T-cell marker was observed in gills, liver, intestine, heart, and brain tissues using RT-qPCR assays. The limited availability of specific antibodies against T-cell markers of brown trout had restricted the cellular immune response studies of any kind. This study demonstrated the production of a polyclonal antibody against CD4-1 of brown trout, for the positive isolation of sub-populations of leukocytes. The study was conducted to investigate the proliferation of CD4+ cells in different tissues during VHSV infection by using the flow cytometry technique. Immunofluorescence staining and RT-PCR analysis validated this antibody against CD4-1 lymphocytes. The CD4+ surface cell expression in lymphoid organs and intestine augmented in the infected group significantly than the non-infected group at specific days post-infection (dpi). The results suggest that the T-helper cells are important against VHSV, which is comparable to a higher vertebrate. Furthermore, higher expression of CD4+ cells in brown trout during VHVS infection may explain the resistance of brown trout to VHSV. These findings also advocate that this polyclonal antibody can be utilized in other immunological experiments as well as for monitoring the health, immune status of brown trout.
Dissertation - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021
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Seit dem Aufkommen neuer Infektionskrankheiten, die eine enorme finanzielle Bedrohung für die Fischaquakultur darstellen, war die Forschung zu Fragen der Fischgesundheit in den letzten zehn Jahren von Bedeutung. Insbesondere der immunologische Aspekt wird als eines der wichtigsten Forschungsgebiete für das Verständnis des Fortschreitens der Krankheit angesehen. Diese Studie wurde entwickelt, um CD4 T-Zellen der Bachforellen zu charakterisieren. Polyklonale Antikörper gegen CD4 Moleküle wurden eingesetzt um den Einfluss der CD4+ Zellen bei der viralen hämorrhagischen Septikämie (VHS) zu untersuchen. Darüber hinaus wurde die Expression der CD4 mRNA untersucht, um ein umfassenderes Bild der Immunantwort bei Bachforellen gegen VHS-Viren zu erhalten. Es konnten drei Gene CD4-1, CD4-2a und CD4-2b identifiziert werden, die mittels einer Homologieklonierung kloniert und weiter charakterisiert wurden. Die erste cDNA von CD4-1 enthielt vier Immunglobulin- Superfamilien-ähnliche Domänen und war 1473 Nukleotide lang, wobei ein offener Leserahmen (ORF) für 490 Aminosäuren codierte. Das CD4-2-Gen schien dupliziert zu sein und die Varianten heißen CD4-2a und CD4-2b. CD-2a und CD4-2b waren 945 und 999 Nukleotide lang mit 2 Immunglobulin-Superfamilien-ähnlichen Domänen und enthielten ORFs mit 313 bzw. 331 Aminosäuren. Alle CD4-Gene von Bachforellen zeigten mit dem Säuger- CD4 vergleichbare Eigenschaften: Sie enthielten extrazelluläre immunglobulin-ähnliche Domänen sowie zytoplasmatische Domänen (Lck) und Aktivierungsmotive auf Tyrosinbasis. Obwohl die Sequenzidentitäten zu Säugetieren gering waren (13-15%), sind sie homolog zu den Säuger-CD4, dies gilt auch für andere veröffentlichte Salmonidensequenzen. Die übersetzte CD4-1-Proteinsequenz für Bachforellen weist eine Identität von 95% und 89% mit Atlantischem Lachs und Regenbogenforellen auf. Während CD4-2a- und CD4-2b- Proteinsequenzen eine Identität von 84% und 97,7% mit Regenbogenforellen bzw. Atlantischem Lachs aufweisen. Die basalen Expressionsniveaus von CD4-mRNA waren am höchsten im Thymus, gefolgt von Kopfniere und Milz. Eine geringere Expression des T-Zell-Markers wurde jedoch in Kiemen-, Leber-, Darm-, Herz- und Hirngewebe unter Verwendung von TaqMan-Assays und RT-qPCR beobachtet. Die begrenzte Verfügbarkeit spezifischer Antikörper gegen T-Zell spezifische Antigen von Bachforellen hatte die zellulären Immunantwortstudien jeglicher Art eingeschränkt. Diese Arbeit zeigte nun die Produktion eines polyklonalen Antikörpers gegen CD4-1 von Bachforellen und dessen Verwendung zur positiven Isolierung von Teilpopulationen von Leukozyten. Die Studie wurde durchgeführt, um die Proliferation von CD4+ -Zellen in verschiedenen Geweben während einer VHSV-Infektion unter Verwendung der Durchflusszytometrie zu untersuchen. Immunfluoreszenzfärbung und RT-PCR-Analyse validierten diesen Antikörper gegen CD4-1-Lymphozyten. Die Expression von CD4+ -Zellen in lymphoiden Organen und im Darm erhöhte sich in der infizierten Gruppe signifikant gegenüber der nicht infizierten Gruppe an bestimmten Tagen nach der Infektion (dpi). Die Ergebnisse legen nahe, dass die CD4+ T-Zellenbei dieser Virusinfektion eine wichtige Rolle spielen. Dieser Umstand ist mit der Rolle von CD4 positiven Zellen bei höheren Wirbeltieren vergleichbar. Darüber hinaus kann eine höhere Expression von CD4+ -Zellen in Bachforellen während einer VHVS-Infektion zur Resistenz gegen das Virus beitragen. Diese Ergebnisse sprechen auch dafür, dass dieser polyklonale Antikörper in anderen immunologischen Experimenten sowie zur Überwachung der Gesundheit und des Immunstatus von Bachforellen verwendet werden kann.
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2021
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