Titel (deu)

Bindungsfähigkeit caniner Spermatozoen nach Tiefgefrierung mit verschiedenen Tiefkühlmedien

Autor*in

Klaudia Csendes

Betreuer*in

Sabine Schäfer-Somi

Begutachter*in

Auke Boersma

Beschreibung (deu)

Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020

Beschreibung (deu)

Ziel dieser Studie war es, die Effekte von Eigelb und Eidotterplasma sowie von Katalase in verschiedenen Tiefkühlverdünnern zur Samentiefgefrierung von Hunden zu untersuchen. In der Diplomarbeit von Burak und Papadopoulos (2019) wurden Samenproben von 17 gesunden Rüden verschiedener Rassen gewonnen, tiefgefroren und nach dem Auftauen auf kinetische Parameter, Viability, Morphologie, Apoptose, Reactive oxygene species (ROS) und DNA Schäden untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden die gleichen Proben auf ihre Bindungsfähigkeit an kanine Oozyten untersucht. Die fraktionierte Samengewinnung wurde bei jedem Hund einmal durchgeführt, nach einer Qualitätsüberprüfung wurden die Samenproben ohne Zentrifugation in drei Aliquots aufgeteilt. Die Aliquots wurden mit Kühlmedien verdünnt (I, II, III), danach wurden die Proben eine Stunde bei +4 °C im Wasserbad äquilibriert und dann das Tiefkühlmedium dazu gemischt (1:1, Endverdünnung 1:3). Die Probe A enthielt TRIS- Fructose-Zitronensäure Verdünner mit Eidotter, Glyzerol und Equex STM Paste. Die Probe B enthielt die gleiche Komponente, aber statt Eidotter wurde Eigelbplasma verwendet. Bei der Probe C wurde ein TRIS-Lecithin Verdünner mit Eidotterplasma, Glyzerol und Equex STM Paste verwendet. Das jeweils zweite Aliquot von Probe B und C wurde zusätzlich mit 300 I.U./mL Katalase angereichert (Bcat und Ccat). Nach Abfüllung in 0,5 ml Pailletten, wurden die Proben mit einem Computer assoziierten Einfrierautomat gefroren (Schäfer-Somi et al. 2006) und bis zur Analyse im flüssigen Stickstoff gelagert. Nach dem Auftauen wurde eine Samenprobe mittels Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) untersucht sowie eine weitere mittels Durchflusszytometrie auf DNA Schäden (Sperm Chromatin Structure Assay; SCSA), reactive oxygen species (ROS) und Apoptose. Mit dem Samen einer weiteren Paillette wurde ein Zona Binding Assay (ZBA) durchgeführt. Die Proben mit Eidotter und Equex STM Paste zeigten eine bessere progressive Motilität (P), den höchsten Prozentsatz an intakten Zellen und den geringsten Prozentanteil an Akrosomschäden und signifikant weniger ROS (p<0.05 bzw p<0.01). Die Proben mit Katalase und Lecithin und Equex STM Paste waren nicht besser, sie enthielten die meisten toten Zellen. Ersatz von Eidotter durch Eidotterplasma erhöhte die Zahl der Zellen mit später Apoptose und die ROS signifikant (Burak und Papadopoulos 2019). In unser Studie zeigten die Proben mit verschiedenen Verdünnungsmedien keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Bindungsfähigkeit. Die Schlussfolgerung ist, dass ein Zwei-Phasenverdünner mit TRIS-EY, Glycerol und Equex STM Paste (A) besser hinsichtlich P, Viability, ROS und Apoptose war, als die anderen Tiefkühl-Medien. Die Ergebnisse von TRIS-EYP mit Glycerol und Equex STM Paste waren ähnlich, allerdings waren mehr ROS und apoptotische Zellen nachweisbar. Die in-vitro Bindungskapazität und VCL waren nicht signifikant unterschiedlich zwischen den Gruppen. Anscheinend waren genügend motile und Membran-intakte Zellen vorhanden, um die Bindung zu gewährleisten. Die Fertilisationskapazität dieser Verdünnungsmedien muss jedoch in-vivo untersucht werden.

Beschreibung (eng)

The aim of this study was to assess the effects of egg yolk, egg yolk plasma and catalase in different freezing extenders on frozen-thawed semen in dogs. In the study of Burak und Papadopoulos (2019), semen samples (main fraction) were collected from 17 healthy dogs of different breeds. The samples were frozen, and after thawing, the quality of the samples was analyzed and parameters like kinetics, viability, morphology, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) and DNA damage evaluated. In this study, the in-vitro binding ability of the previously mentioned samples was examined. Fractionated semen collection was done once from each of the dogs. After quality evaluation of the specimens, they were devided without centrifugation into three aliquots. The aliquots were diluted 1:1 with cooling extender (I, II, III), afterwards the samples were equalibrated for one hour in a water bath at+4 °C, then the freezing extender was added (1:1, final dilution rate 1:3). Sample A contained TRIS-fructose-citric acid extender with egg yolk, glycerol and Equex STM Paste. Sample B contained the same components, but egg yolk plasma was used, instead of egg yolk. In sample C, a TRIS –based lecithin extender was used with egg yolk plasma, glycerol and Equex STM Paste. The second aliquots of sample B and C were enriched with 300 I.U./mL catalase (Bcat and Ccat). After filling in 0,5 ml straws the samples were frozen in a computer-assisted freezing automat (Schäfer-Somi et al 2006) and stored in liquid nitrogen until analysis. After thawing, a computer assisted sperm analyser (CASA) was used for quality assessment. Furthermore, flow cytometry was used for a sperm chromatin structure assay (SCSA) and examination for ROS and apoptosis. Finally, a Zona Binding Assay (ZBA) was done with semen from one more straw. The samples with egg yolk and Equex STM Paste showed better progressive motility (P), the highest percentage of intact cells and the lowest percentage of acrosome damage and significant less ROS (p<0.05 and p<0.01) than the other samples. The samples with catalase and lecithin were not better, the amount of dead cells were at maximum. The replacement of egg yolk with egg yolk plasma increased the number of cells with late apoptosis and the ROS significantly (Burak und Papadopoulos 2019). In our study the samples with different extenders showed no significant difference in their binding ability. The final conclusion is that a two-phase freezing medium with TRIS-EY, glycerol and Equex STM paste (A) is better with regards to P, viability, ROS and apotosis. The results of TRIS-EYP, glycerol and Equex STM Paste were similar, though more ROS and apototic cells were detected.. In-vitro binding ability and VCL did not differ significantly between groups. Apparently there were enough motile and membrane intact cells to achieve binding. The fertilizing capacity of the extenders should be examined in-vivo.

Sprache des Objekts

Deutsch

Datum

2020

Rechte

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