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Title (eng)
An influence of m6A methylation on the infectivity of mouse mammary tumor virus
Author
Tanja Kusstatscher
Assessor
Dieter Klein
Degree supervisor
Stanislav Indik
Description (eng)
Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023
Abstract (eng)
Numerous epitranscriptomic modifications were identified in cellular and viral mRNAs. The most common modification is the methylation of the Adenosine (m6A) that is deposited onto mRNA with the help of a cellular enzyme, methyl transferase METTL3. The presence of the N6-methyladenosine in mRNA was proposed to influence various aspects of the mRNA life cycle including the stability, splicing, nuclear export, and translation. Viruses hijack cellular pathways to facilitate the nucleo-cytoplasmic transport of viral RNAs. They serve as excellent model organisms to study RNA transport as they contain cis-acting sequence elements recognized by cellular nuclear export factors. Recent reports showed that the m6A modifications in the retroviral mRNAs have some effect on the viral gene expression levels and ultimately on virus infectivity. However, the mechanism responsible for this observation and the importance for the virus life cycle remains controversial. We hypothesized that the m6A methylation influences the interaction between retroviral RNA and cellular nuclear RNA export factors thereby affecting the translocation of viral RNA into the cytoplasm and resulting in reduced production of viral particles and loss of infectivity. To test this hypothesis, we knocked out the Mettl3 gene from the human genome by using the CRISPR/Cas9 system and used modified and control cells to produce a prototypic mouse retrovirus mouse mammary tumor virus (MMTV) to monitor changes in the virus infectivity. Furthermore, we used the METTL3-lacking cells to determine the nuclear RNA export efficiency using a GFP-based nuclear export assay previously established in the laboratory. In this assay, we tested the methylation-dependent activity of three export elements: 1) the Rev-response element from HIV-1 (RRE, in conjunction with the trans-acting factor Rev), 2) the constitutive transport element (CTE) from Mason-Pfizer monkey virus (MPMV) and 3) a novel cis-acting RNA element, derived from the 5’ end of MMTV env mRNA, MPPE. We did not observe a reduced infectivity of MMTV produced in cells lacking METTL3 compared to the virus produced in wild-type cells. Furthermore, no significant difference in mRNA export between the wild-type and knockout groups could be detected with neither of the export elements. A tendency of reduced mRNA export in the knockout group is visible for some export elements. In conclusion, we did not observe any influence on retroviral mRNA nuclear export and MMTV infectivity caused by the m6A modification.
Description (deu)
Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023
Abstract (deu)
Zahlreiche epitranskriptomische Modifikationen wurden in zellulären und viralen mRNAs identifiziert. Die häufigste Modifikation ist die Methylierung des Adenosins (m6A), die mit Hilfe eines zellulären Enzyms, der Methyltransferase METTL3, an die mRNA angehängt wird. Es wurde vermutet, dass das Vorhandensein von N6-Methyladenosin an mRNA verschiedene Aspekte des mRNA-Lebenszyklus beeinflusst, unteranderem Stabilität, Spleißen, Export aus dem Zellkern und Translation. Viren nutzen zelluläre Signalwege, um den nukleozytoplasmatischen Transport viraler RNAs zu erleichtern. Sie dienen als hervorragende Modellorganismen zur Untersuchung des RNA-Transports, da sie cis-aktive Sequenzelemente enthalten, die von zellulären nukleären Exportfaktoren erkannt werden. Jüngste Berichte zeigten, dass die m6A-Modifikationen in den retroviralen mRNAs einen gewissen Einfluss auf die viralen Genexpressionsniveaus und letztendlich auf die Virusinfektiosität haben. Der für diese Beobachtung verantwortliche Mechanismus und die Bedeutung für den Viruslebenszyklus bleiben jedoch umstritten. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass die m6A-Methylierung die Wechselwirkung zwischen retroviraler RNA und zellulären nukleären RNA-Exportfaktoren beeinflusst und dadurch die Translokation viraler RNA in das Zytoplasma beeinflusst, was zu einer verringerten Produktion viraler Partikel und einem Verlust der Infektiosität führt. Um diese Hypothese zu testen haben wir das Mettl3-Gen aus dem menschlichen Genom mittels des CRISPR/Cas9-Systems ausgeschaltet und modifizierte sowie Kontrollzellen verwendet, um ein prototypisches Retrovirus, das Maus-Mammary-Tumorvirus (MMTV), zu produzieren und Veränderungen in der Infektiosität des Virus festzustellen. Darüber hinaus haben wir Zellen ohne funktionsfähiges METTL3-Gen verwendet, um die Effektivität der nuklearen RNA-Exportes zu bestimmen. Dies wurde mithilfe eines im zuvor etablierten GFP-basierten nuklearen Exportassays, gemacht. In diesem Assay haben wir die methylierungsabhängige Aktivität von drei Exportelementen getestet: 1) das Rev-Response-Element von HIV-1 (RRE, in Verbindung mit dem trans-wirkenden Faktor Rev), 2) das konstitutive Transportelement (CTE) vom Mason-Pfizer-Affenvirus (MPMV) und 3) ein neues cis-wirkendes RNA-Element, abgeleitet vom 5'-Ende der MMTV-env-mRNA, MPPE. Wir haben keine verringerte Infektiosität von MMTV beobachtet, dass in Zellen ohne METTL3 produziert wurde, verglichen mit dem Virus, das in Wildtyp-Zellen produziert wurde. Darüber hinaus konnte mit keinem der Exportelemente ein signifikanter Unterschied im mRNA-Export zwischen der Wildtyp- und der Knockout-Gruppe festgestellt werden. Bei einigen Exportelementen ist eine Tendenz zu einem verringerten mRNA-Export in der Knockout-Gruppe erkennbar. Zusammenfassend haben wir keinen Einfluss der m6A-Modifikation auf den nukleären Export retroviraler mRNA und die Infektiosität von MMTV festgestellt.
Type (eng)
Master theses
Language
[eng]
Persistent identifier
https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:4107
AC number
AC17416099
Number of pages
XI, 56
Date issued
2023
License
All rights reserved