Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020

Leishmaniasis is one of the most important tropical diseases caused by different protozoal species of the genus Leishmania with the sand fly as their vector. There are about two million new cases and 70.000 deaths per year due to this disease. Because of climate change and spreading of the sand fly vector, these numbers will increase in the future also in previously non-endemic areas. Although some treatment options are available, an affordable, effective and safe treatment is difficult to find. This is due to resistance development, side effects and high costs of drugs. Thus, there is a high need of new treatment options against leishmaniasis. In the recent years, it was shown that endoperoxides are potentially suitable to treat leishmaniasis and that their activation to radicals is essential for their pharmacological activity. For some endoperoxides, such as ascaridole, the formation of primary radicals was detected in both biomimetic systems and in Leishmania tarentolae promastigotes by electron paramagnetic resonance spectroscopy. However, even for some highly active endoperoxides radical detection by electron paramagnetic resonance spectroscopy in Leishmania often was not successful, despite radical scavengers had a clear negative effect on the antileishmanial activity of these endoperoxides. So far, only a few drug-derived (primary) radicals of endoperoxides have been detected and identified by using DMPO as spin trap in biomimetic systems and in Leishmania by electron paramagnetic resonance spectroscopy. In this work we showed in biomimetic systems that radical detection from endoperoxides (ascaridole and artemisinin) and H2O2 by electron paramagnetic resonance spin trapping is already dependent on buffer composition, time points and subsequent reactions of the spin adducts. For the first time in an aqueous system without significant amounts of organic solvents, the detection of radicals from artemisinin triggered by Fe2+ was achieved by electron paramagnetic resonance spin trapping. In cellular Leishmania tarentolae promastigotes suspensions primary radicals derived from the endoperoxide ascaridole but not from the endoperoxide artemisinin were detected by electron paramagnetic resonance spin trapping. Furthermore, this study established an extraction procedure for lipophilic spin adducts. However, identification of extracted spin adducts was impaired by a strong background signal, which arose from impurities in the spin trap itself. This work provides a more systematic understanding of electron paramagnetic resonance spin trapping results from activated endoperoxides and gives inspirations for future experiments.

Leishmaniose ist eine der wichtigsten tropischen Krankheiten mit der Sandmücke als Vektor. Sie wird durch verschiedene Spezies der Gattung Leishmania verursacht. Jährlich erkranken schätzungsweise zwei Millionen Menschen an Leishmaniose und ungefähr 70.000 sterben daran. Aufgrund der globalen Erwärmung und der damit verbundenen Ausbreitung der Sandmücke bis in Gebiete, in denen sie momentan noch nicht vorzufinden ist, werden diese Zahlen in der Zukunft ansteigen. Derzeit gibt es bereits einige Behandlungsoptionen, aber die gegenwärtigen Therapiemöglichkeiten sind limitiert, aufgrund von Resistenzentwicklungen, starken Nebenwirkungen aber auch hohen Kosten der Medikamente. Daher besteht ein hoher Bedarf an neu entwickelten Wirkstoffen gegen Leishmaniose. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Endoperoxide mögliche Kandidaten für eine Behandlung von Leishmaniose sind und dass ihre Aktivierung in Verbindung mit Radikalbildung wichtig für ihre pharmakologische Aktivität ist. Für Endoperoxide, wie beispielsweise Ascaridol wurde die Bildung von primären Radikalen sowohl im biomimetischen System als auch in Leishmania tarentolae Promastigoten mittels Elektronenspinresonanz Spektroskopie nachgewiesen. Radikale konnten jedoch oft für manche hochaktive Endoperoxide in Leishmanien nicht erfolgreich mittels Elektronenspinresonanz Spektroskopie nachgewiesen werden, obwohl Radikalfänger einen klaren negativen Effekt auf die antileishmaniale Aktivität dieser Endoperoxide zeigten. Bis jetzt konnten nur ein paar von Wirkstoffen abgeleitete (primäre) Radikale der Endoperoxide mittels Elektronenspinresonanz Spektroskopie unter der Verwendung von DMPO als Spin Trap sowohl im biomimetischen System als auch in Leishmanien detektiert und identifiziert werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der Nachweis von Radikalen von Endoperoxiden (Ascaridol und Artemisinin) und H2O2 durch Elektronenspinresonanz Spin Trapping bereits im biomimetischen System von der Pufferzusammensetzung, den Messzeitpunkten und nachfolgenden Reaktionen der Spin Addukte abhängig ist. Zum ersten Mal wurde im wässrigen System ohne signifikante Zugabe von organischen Lösungsmitteln der Nachweis von Radikalen von Artemisinin, ausgelöst durch Fe2+ über Elektronenspinresonanz Spin Trapping erfolgreich durchgeführt. In Zellsuspensionen mit Leishmania tarentolae Promastigoten konnten nur primäre Radikale, abgeleitet von Ascaridol, nicht jedoch von Artemisinin mittels Elektronenspinresonanz Spin Trapping nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit eine Methode für die Extraktion von lipophilen Spin Addukten etabliert. Die Identifikation der extrahierten Spin Addukte wurde jedoch sehr von einem starken Hintergrundsignal beeinträchtigt, welches aufgrund der Verunreinigungen des Spin Traps selbst entstanden ist. Diese Arbeit verschafft ein höheres systematisches Verständnis der Elektronenspinresonanz Spin Trapping Ergebnisse von aktivierten Endoperoxiden und bietet viele neue Ansatzpunkte für zukünftige Experimente

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80 Blätter