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Understanding brachyury genetics and developing strategies to target brachyury in chordoma
Kerstin Kornelson
Karoline Kollmann
Heidi Neubauer
Paul Workman
Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023
Chordoma is a rare primary bone cancer that is dependent on the expression of the transcription factor brachyury (T). To better understand the drivers of this cancer, the chordoma associated SNP rs2305089, was investigated in nine chordoma cell lines and two non-chordoma cell lines. Sanger sequencing revealed that the SNP variant only occurs in chordoma cell lines and mostly in a homozygous form. It was not found in the non-chordoma cell lines sequenced. This data confirms the association of the SNP rs2305089 with chordoma. Chordomas are largely resistant to conventional chemotherapies and are prone to recurrence and metastasis despite surgical removal and radiotherapy, the current standard of care. Therefore, the development of a targeted therapy is of utmost importance. Brachyury is considered as the ideal therapeutic target as it is minimally present in healthy tissues yet chordoma cells require it to grow. This work provides evaluation of novel compounds intended to selectively inhibit brachyury. These inhibitors were tested in cell-based assays focusing on their impact on brachyury protein levels, cell viability, the induction of senescence and target engagement. The two most promising covalent compounds CF-8-70 and CF-8-137 modulate brachyury, induce senescence, and are less toxic than other analogues. Washout of these inhibitors maintained cellular senescence, which is the phenotypic outcome of selective brachyury inhibition. Moving forward, as the covalent compounds bind to a specific cysteine residue on the brachyury protein, a serine mutant was engineered using CRISPR-Cas9. This mutant cell line allows further improvement of compound selectivity for brachyury. Compared to developing a brachyury selective chemical probe, transcriptional CDK inhibition represents an immediately actionable approach to treat chordoma. The T gene is driven by a super enhancer and this regulation confers sensitivity to inhibitors of transcriptional CDK. This thesis adds to the evaluation of the clinical-grade transcriptional CDK inhibitor fadraciclib on its ability to modulate brachyury in chordoma cells and in vivo. Chordoma cells show sensitivity to fadraciclib and treatment successfully depletes brachyury protein levels. In addition, the determination of a maximum tolerated dose in a CH22 xenograft mouse model was started. However, no reduction in brachyury protein levels was achieved with the administered dose in this study.
Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023
Das Chordom ist ein seltener primärer Knochenkrebs, der von der Expression des Transkriptionsfaktors Brachyury (T) abhängig ist. Um die Genetik dieser Krebsart besser zu verstehen, wurde der mit dem Chordom assoziierte SNP rs2305089 in neun Chordom-Zelllinien und zwei Nicht-Chordom-Zelllinien untersucht. Die durchgeführte Sanger-Sequenzierung ergab, dass der SNP nur in Chordom-Zelllinien vorkommt, wo er meist homozygot vorliegt. In den sequenzierten Nicht-Chordom-Zelllinien wurde er nicht gefunden. Diese Ergebnisse bestätigen den Zusammenhang zwischen dem SNP rs2305089 und dem gehäuften Auftreten von Chordomen. Chordome sind weitgehend resistent gegen Chemotherapien und neigen trotz chirurgischer Entfernung und Strahlentherapie zu Rückfällen und Metastasenbildung. Daher ist die Entwicklung einer zielgerichteten Therapie von größter Bedeutung. Brachyury wird als ideales therapeutisches Ziel angesehen, da es in gesundem Gewebe kaum vorhanden ist und für das Wachstum von Chordom-Zellen essenziell ist. Im Rahmen dieser Masterarbeit wurden neuartige Verbindungen untersucht, die Brachyury selektiv hemmen sollen. Diese Inhibitoren wurden in zellbasierten Assays getestet, wobei der Schwerpunkt auf ihren Auswirkungen auf den Brachyury-Proteinspiegel, die Lebensfähigkeit der Zellen, die Induktion von Seneszenz und die Binding an Brachyury innerhalb der Zelle liegt. Die beiden vielversprechendsten kovalenten Verbindungen CF-8-70 und CF-8-137 inhibieren Brachyury, induzieren Seneszenz und sind weniger toxisch als andere Analoga. Selbst nach Entfernung dieser Inhibitoren blieb die zelluläre Seneszenz erhalten, die das phänotypische Ergebnis einer selektiven Brachyury-Hemmung widerspiegelt. Da die kovalenten Verbindungen an einen spezifischen Cysteinrest des Brachyury-Proteins binden, wurde mithilfe von CRISPR-Cas9 eine Serin-Mutante generiert. Diese mutierte Zelllinie ermöglicht die Selektivität der Verbindungen für Brachyury zu überprüfen und zu verbessern. Während der Entwicklung selektiver Brachyury-Hemmer, könnten transkriptionelle CDKHemmer eine unmittelbare Möglichkeit zur Behandlung des Chordoms darstellen. Teil dieser Masterarbeit ist die Evaluierung des CDK-Hemmers Fadraciclib in Chordomzellen und in vivo. Es konnte bestätigt werden, dass Chordomzellen empfindlich gegenüber Fadraciclib sind und gleichzeitig die Brachyury inhibiert wird. Darüber hinaus wurde mit der Bestimmung einer maximal tolerierten Dosis in vivo begonnen. Jedoch wurde in dieser Studie mit der verabreichten Dosis keine Senkung des Brachyury-Proteinlevels erzielt.
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2023
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