Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2022

Hematopoiesis is a highly regulated process to maintain a balance of the different hematopoietic cells. Each subset is defined by a particular gene expression landscape that varies throughout differentiation from a hematopoietic stem cell (HSC) to a mature cell. Upon diseases such as cancer, deregulated expression of certain proteins can lead to an expansion or loss of individual subsets. Previous studies by our group have identified Evi2a to be essential to the specification of definitive hematopoietic stem and precursor cells (HSPCs) during embryonic development. Besides this, little is known about the supposed transmembrane protein Evi2a. In the following study, we therefore set out to investigate the influence of Evi2a on adult hematopoietic differentiation in vivo. To achieve this, a CRISPR/Cas9 system was developed to knock out (KO) Evi2a using a lentiviral vector. Successful KO was validated in murine fibroblastic and acute myeloid leukemia (AML) cell lines on a genomic and transcriptomic level. Afterwards, murine Lin- Sca1+ cKit+ (LSK) cells were isolated and transduced in vitro. Using these, in vitro colony forming unit (CFU) potential was assessed and cells were transplanted into recipient animals. Donor chimerism, as well as B cell, T cell and myeloid cell populations in the peripheral blood were analyzed in 4-week intervals. Next to flow cytometric analysis, cells were sorted to determine the presence of a genetic lesion at the evi2a locus in the differentiated populations. The preliminary data collected so far indicates no impairment of hematopoietic differentiation upon KO of Evi2a, but further timepoints will have to be analyzed. Besides evaluating the effect of an Evi2a KO on hematopoiesis, we established a new protocol for creating a gene KO in LSK cells and subsequent transplantation. In the future, this will enable studies of gene functions in vivo without the costly and time-consuming process of creating new transgenic mouse lines.

Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2022

Hämatopoese ist ein hoch regulierter Prozess, um die Balance der verschiedenen hämatopoetischen Zellen zu gewährleisten. Jeder Zelltyp wird über eine bestimmte Genexpressions-Landschaft definiert, die sich im Laufe der Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen zu ausgereiften Zellen variiert. In Krankheitsbildern wie zum Beispiel Leukämien, kann eine fehlregulierte Genexpression von bestimmten Proteinen zu einer Vermehrung oder Verlust von einzelnen Subtypen führen. Studien, die zuvor von unserer Gruppe durchgeführt wurden, haben festgestellt, dass Evi2a eine essenzielle Rolle in der Spezifikation von definitiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläufer Zellen während der Embryogenese spielt. Abgesehen davon ist bisher wenig über das Transmembranprotein Evi2a bekannt. Das Ziel der folgenden Studie ist daher den Einfluss von Evi2a auf die adulte Hämatopoese in vivo zu testen. Dafür wurde ein CRISPR/Cas9 System entwickelt, um Evi2a mit Hilfe von lentiviraler Transduktion auszuknocken. Um den Knockout auf genomischer und transkriptomischer Ebene zu validieren, wurden zusätzlich murine Fibroblasten und murinen Zellelinien für Akute Myeloide Leukämie transduziert und sequenziert. Daraufhin wurden murine Lin- Sca1+ cKit+ (LSK) Zellen isoliert und ebenfalls in vitro transduziert. Diese wurden das in vitro auf das Potenzial zur Kolonie Formation getestet und in Empfängermäuse transplantiert. Sowohl der Spenderchimerismus also auch B Zellen, T Zellen und myeloide Zellpopulationen wurden im peripheren Blut in 4-Wochen Intervallen analysiert. Die Zellen wurden mit anhand von Durchflusscytometrie analysiert und anschließend sortiert, um festzustellen, ob der evi2a Genelokus eine Läsion aufweist. Die bisher gesammelten Daten lassen vermuten, dass der Evi2a Knockout keinen Einfluss auf die hämatopoetische Differenzierung hat, es ist jedoch notwendig noch weitere Zeitpunkte zu analysiere. Neben der Evaluierung eines Effekts von Evi2a in der Hämatopoese, konnten wir ein Protokoll etablieren, um ein Gen nach Wahl in LSK Zellen auszuknocken und zu Zellen anschließend zu transplantieren. In Zukunft wird dieses Protokoll angewendet werden können, um Genfunktionen in vivo zu testen, ohne die kostspielige und zeitintensive Erschaffen von neuen Transgenen Mauslinien.

Hematopoiesis, CHRISPR/Cas9, Bone marrow transplantation, EVI2A

application/pdf

VIII, 52 Blätter