Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2019

Das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, kurz PRRSV, gehört zur Familie der Arteriviridae, liegt einzelsträngig sowie in positiver Polarität vor. Es ist der Verursacher einer der wichtigsten Erkrankungen in der Schweinemedizin, welche jedes Jahr hohe wirtschaftliche Verluste verursacht. Die Verfügbarkeit infektiöser cDNA-Klone bietet die Möglichkeit zur Analyse, und Modifizierung viraler Genome auf molekularer Ebene und hat die Erforschung der Virusreplikation, Pathogenese und der Entwicklung von neuen Impfstoffen stark unterstützt. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen molekularen cDNA-Klon des Feldisolates Aut 14-440 zu konstruieren, da dieser Besonderheiten im Genom sowie in der von ihm ausgelöster Klinik aufweist. Anders als bei früheren Versuchsansätzen, bei denen durch zahlreiche Klonierungsschritte häufig Fehler in die Sequenz gelangen konnten, wurde durch die Kombination von neuen, leistungsfähigen Enzymen für die PCR und der „Gibson assembly“ Technologie ein höherer Grad an Sequenzstabilität bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuchen erreicht. Die wichtigsten Klonierungsschritte waren die Ermittlung des korrekten 5‘ Endes, die Ermittlung des korrekten 3‘ Endes und die Klonierung möglichst langer zusammenhängender cDNA Fragmente. Der finale Klon, pAX3, wurde in empfängliche Zellen mittels Elektroporation eingebracht und nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden wurden diese Zellen fixiert, permeabilisiert und mit einem Cy5 konjugiertem Antikörper gegen das N-Protein inkubiert. Ohne Virusreplikation in der Zelle wäre auch kein N-Protein nachweisbar. Das bedeutet im Umkehrschluss, dass eine im Fluoreszenzmikroskop erkennbare rote Färbung einzelner Zellen ein guter Hinweis auf stattgefundene Virusreplikation ist. Dies war, zusammen mit der Verteilung des Antigens im Zytoplasma, ein Beweis dafür, dass pAX3 replikationsfähig ist.

The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV for short, belongs to the family Arteriviridae, is single-stranded and has a positive polarity. It is the cause of one of the most important diseases in pig medicine, which causes high economic losses every year. The availability of infectious cDNA clones provides the potential for analysis and modification of viral genomes at the molecular level and has strongly supported the study of virus replication, pathogenesis, and the development of new vaccines. The aim of this work was to construct a molecular cDNA clone of the field isolate Aut 14-440, as it exhibits peculiarities in the genome as well as in the clinical symptoms that it triggered. Unlike previous approaches, where multiple cloning steps often allowed for errors in the sequence, the combination of new, high-performance enzymes for PCR and the Gibson assembly technology resulted in a higher level of sequence stability in the experiments performed in this work. The most important cloning steps were the determination of the correct 5 'end, the determination of the correct 3' end and the cloning of contiguous cDNA fragments as long as possible. The final clone, pAX3, was electroporated into susceptible cells and after 48 hours of incubation, these cells were fixed, permeabilized and incubated with a Cy5-conjugated antibody against the N-protein. Without virus replication in the cell, no N-protein would be detectable. This implies, conversely, that a red staining of individual cells recognizable in the fluorescence microscope is a good indication of the virus replication that has taken place. This, together with the distribution of the antigen in the cytoplasm, proved that pAX3 is replicable.

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48 Blätter