Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2022

In dieser Diplomarbeit wurde die Koexpression der Hitzeschockproteine HSP60 und HSP70 im Gewebe von Ovarien und Plazenta gravider und nicht gravider Hündinnen untersucht. Weiters wurden die Faktoren Kinase 67 und Caspase 3 beurteilt, um eine mögliche Aussage über die lokale Apoptose und Proliferation treffen zu können. Daher wurde folgende Hypothese aufgestellt: HSP60 und HSP70 werden im Verlauf der Frühgravidität, Graviditätsmitte und am Graviditätsende im Plazenta- und Ovargewebe gravider Hündinnen spezifisch und anders als bei nicht-tragenden Hündinnen exprimiert und außerdem sind Kinase67 und Caspase3 an der lokalen Apoptose und Proliferation beteiligt, wobei letzteres nur im Falle einer eventuellen Koexpression vermutet werden kann. Für diese Studie standen daher 18 vorberichtlich gesunde Hündinnen im Alter zwischen ein und drei Jahren zur Verfügung. Neun Hündinnen waren trächtig und befanden sich in unterschiedlichen Trächtigkeitsstadien und neun Tiere wiesen keine Gravidität auf. Alle Gewebeproben von Plazenta und Ovarien der 18 Hündinnen wurden mittels Immunhistochemie angefärbt, mikroskopisch beurteilt und fotographiert. Anschließend folgte eine statistische Auswertung der positiv gefärbten und negativen Zellen mit dem Computerprogramm FIJI und Microsoft Excel 2016. Die wesentlichen, quantitativen Endergebnisse dieser Diplomarbeit zeigen, dass der Anteil an HSP70 und Kinase 67 positiven Zellen im Follikelgewebe in allen fünf Versuchsgruppen annähernd gleich groß war (84-100 % und 7,3-14,8 %). Im Gelbkörpergewebe fiel die Expression in allen fünf Gruppen gleichermaßen geringer aus (HSP70: 8-44 %, KI67: 0,6-1 %). Nach der qualitativen, beschreibenden Auswertung zeigte sich, dass die Expression von HSP60 im Follikelgewebe zum Ende der Gravidität hin am stärksten war, im Corpus luteum-Gewebe war die Expression von HSP60 bei nicht trächtigen und trächtigen Tieren annähernd gleich stark. Caspase 3 wurde nur vereinzelt im Follikelgewebe, aber stark im Gelbkörpergewebe exprimiert, wobei Caspase 3 am stärksten bei nicht tragenden Hündinnen exprimiert wurde. Die Endauswertungen der Plazentaproben zeigten, dass ein hoher Anteil der Zellen aller Plazentaschichten positiv angefärbt war. HSP70 wurde am stärksten im Myometrium der Plazenta exprimiert (Tag 35-40: 48,64 %, ~Tag 66: 83,67 %), wobei sowohl HSP60, als auch HSP70 in allen Schichten der Plazenta am Graviditätsende stärker exprimiert wurden als noch während der Graviditätsmitte. HSP60 wurde am Ende der Gravidität am stärksten im Plazentalabyrinth exprimiert. Kinase 67 wurde am stärksten in den Zellen der tiefen und oberflächlichen Drüsenschicht sowie im Plazentalabyrinth exprimiert, Caspase 3 hingegen am stärksten im Myometrium, vor allem zum Ende der Gravidität hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hitzeschockproteine HSP60 und HSP70 in Plazenta und Ovarien gravider und nicht gravider Hündinnen deutlich exprimiert werden. Dabei zeigt sich vor allem die Tendenz, dass die Anzahl an exprimierten Hitzeschockproteinen im Plazentagewebe im Verlauf der Trächtigkeit zunimmt. Dies kann als mögliche „Stressantwort“ auf die körperliche Belastung einer graviden Hündin angesehen werden, unter anderem die Vorbereitung des Körpers auf die Geburt der Welpen, die starke Zunahme an Körpergewicht, der umgestellte Hormonhaushalt sowie die Vorbereitung auf die Laktation. Ebenso zeigt sich eine vermehrte Expression von Kinase 67 und Caspase 3 in allen Schichten der Plazenta bei endgraviden Hündinnen. Die gesteigerte Expression von HSP60 und 70 parallel zur Caspase 3 könnte als physiologisches Regulationsmittel während der Geburt und der Plazentalösung dienen. Das Gleiche gilt möglicherweise auch für die Regulierung im Gelbkörpergewebe. Dies erfordert jedoch weitere Untersuchungen. Auf diese Pilotstudie sollten weitere immunhistochemische Untersuchungen von Plazenta- und Ovargewebe folgen, um genauere Aussagen zur spezifischen Expression von Hitzeschockproteinen bei graviden und nicht graviden Hündinnen liefern zu können.

In this diploma thesis, the co-expression of the heat shock proteins HSP60 and HSP70 in the tissue of the ovaries and placenta of pregnant and non-pregnant bitches was investigated. Moreover, the factors kinase 67 and caspase 3 were examined in order to draw conclusions on local apoptosis and proliferation. Therefore, the following hypothesis was pronounced: HSP60 and HSP70 are expressed in the course of early pregnancy, mid-pregnancy and end of pregnancy in the placenta and ovarian tissue of pregnant bitches specifically and differently than in non-pregnant bitches, and kinase67 and caspase3 are involved in local apoptosis and proliferation; however, the latter can only be assumed in the case of a possible co-expression. For this study, 18 healthy bitches one to three years old were used. Nine bitches were pregnant, all of them in different stages of pregnancy and nine animals showed no pregnancy. All tissue samples from the placenta and ovaries of the 18 bitches were stained immunohistochemically, analyzed microscopically and photographed for further evaluation. This was followed by a statistical analysis of the positive and negative cells with the computer program FIJI and Microsoft Excel 2016. The essential, quantitative results of this thesis show that the percentage of HSP70 and kinase 67 positive cells in the follicular tissue was approximately the same in all five test groups (84-100 % and 7,3-14,8 %). In the corpus luteum, the expression was equally lower in all five groups (HSP70: 8-44 %, KI67: 0,6-1 %). The qualitative, descriptive evaluation demonstrated that the expression of HSP60 in the follicular tissue was strongest towards the end of pregnancy, in the corpus luteum tissue the expression of HSP60 was almost equal in non-pregnant and pregnant animals. Caspase 3 was only sporadically expressed in follicular tissue but highly in the luteal tissue, with caspase 3 being strongest expressed in non-pregnant bitches. The final evaluation of the placenta samples showed a high percentage of cells from all placental layers stained positively. HSP70 was expressed most strongly in the myometrium of the placenta (day 35-40: 48,64 %, ~day 66: 83,67 %), with both HSP60 and HSP70 being expressed more strongly in all layers of the placenta at the end of pregnancy than during mid-pregnancy. HSP60 was most expressed in the placental labyrinth at the end of pregnancy. Expression of kinase 67 was highest in the cells of the deep and superficial glandular layer and in the placental labyrinth, whereas caspase 3 was most expressed in the myometrium, especially towards the end of pregnancy. To summarize, heat shock proteins are clearly expressed in the placenta and ovaries of pregnant and non-pregnant bitches. The expression of heat shock proteins in placental tissue increased in the course of pregnancy and this might be a possible "stress response" to the physical strain of a pregnant bitch, like the preparation of the body for the birth of puppies, as well as the strong gain in body weight, the change in the hormone balance, and the preparation for lactation. Furthermore, there is also an increased expression of kinase 67 and caspase 3 in the placental tissues of end-gravid bitches. The increasing expression of HSP60 and 70 in parallel to caspase 3 might be a physiological part of the regulation of parturition and placental separation. Same may be applicable for the corpus luteum regulation. However, this requires more investigations. This pilot study should be followed by further immunohistochemical examinations of placental and ovarian tissues in order to provide more precise information on the specific expression of heat shock proteins in pregnant and non-pregnant bitches.

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