Description (en)
Acute myeloid leukaemia (AML) is a hematopoietic malignancy, which can arise from mutations in diverse differentiation-driving transcription factors leading to uncontrolled proliferation and aberrant differentiation of myeloid progenitors at the expense of terminally differentiated blood cells. One essential driver of myeloid differentiation is the CCAAT/enhancer-binding protein alpha (C/EBPα) transcription factor, which is mutated in 10-15 % of all AML patients. The CEBPA gene encodes a full-length p42 and a shorter p30 isoform by the use of two translation initiation codons in the CEBPA mRNA. Both mono- and biallelic CEBPA mutations (CEBPAmo/bi) frequently lead to aberrant production of the p30 isoform, which has been shown to act as a gain-of-function variant. However, the exact molecular mechanisms leading to oncogenic transformation by CEBPA mutations are still unknown. Moreover, CEBPA is frequently co-mutated with TET2 in 44.4 % of CEBPAmo patients and in 34.8 % of CEBPAbi patients. TET2 is an important epigenetic modifier that demethylates DNA and thereby can regulate the chromatin accessibility. RNA sequencing data from human AML patients as well as from murine cell lines and AML mouse models for CEBPA-TET2 mutations showed that GATA2, a transcription factor that ensures the differentiation and production of granulocytes and macrophages, is downregulated upon CEBPA-TET2 co-mutation. The aim of this study was to investigate how the level of Gata2 expression affects proliferation of Cebpa-mutated cells and how mutated Cebpa cooperates with Tet2 mutations to reduce Gata2 expression. For this, we performed competition assays with eleven Cebpa-mutated clones that carry heterozygous Gata2 mutations using CRISPR and CRISPRi to target the -77 kb enhancer of Gata2. We measured Gata2 expression via qPCR and determined the effect of Gata2 expression on cell viability. In addition, we performed ChIP-qPCR on four Tet2 knock-out clones and four wild type clones to investigate if reduced Gata2 expression is the result of reduced binding of p30 to the Gata2 -77 kb enhancer upon Tet2 knockout. We found no conclusive correlation between Gata2 expression levels and proliferation in our cell line models. As we found no difference in p30- binding in the Gata2 gene region in co-mutated cells, we hypothesize that the two mutations cooperate via a different mechanism.
Description (en)
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine hämatopoetische Krebserkrankung, die durch Mutationen in verschiedenen differenzierungstreibenden Transkriptionsfaktoren entstehen kann. Bei AML kommt es zur unkontrollierten Proliferation und aberranter Differenzierung von myeloischen Vorläuferzellen. Dadurch wird die Produktion von ausdifferenzierten Blutzellen gestört. Ein essentieller Transkriptionsfaktor der myeloischen Differenzierung ist das CCAAT/Enhancer-Binding Protein Alpha (C/EBPα), das bei 10 bis 15 % aller AML- Patienten mutiert ist. Das CEBPA-Gen kodiert für eine vollständige p42-Isoform und eine kürzere p30-Isoform durch Verwendung von zwei internen Translations-Inititationscodons in der CEBPA mRNA. Sowohl mono- als auch biallelische CEBPA-Mutationen (CEBPAmo/bi) führen häufig zu einer gestörten Produktion der p42-Isoform, wodurch nur mehr die p30- Isoform produziert wird, die sich als Gain-of-function-Variante erwiesen hat. Die genauen Mechanismen, durch welche mutiertes C/EBPα zur malignen Transformation führen, sind jedoch unbekannt. 44,4 % der CEBPAmo-Patienten und 34,8 % der CEBPAbi-Patienten weisen auch Mutationen im TET2 Gen auf. TET2 ist ein wichtiger epigenetischer Regulator, der DNA demethyliert und dadurch die Zugänglichkeit des Chromatins regulieren kann. RNA- Sequenzierungsdaten von menschlichen AML-Patienten sowie von murinen Zelllinien und Mausmodellen für CEBPA-TET2-Mutationen zeigten, dass GATA2, ein essentieller Transkriptionsfaktor, der die Differenzierung und Produktion von Granulozyten und Makrophagen sicherstellt, bei einer CEBPA-TET2-Ko-Mutation herunterreguliert wird. Ziel der Studie war es zu untersuchen, wie der Grad der Gata2-Expression die Proliferation von Cebpa-mutierten Zellen beeinflusst und wie Cebpa mit Tet2-Mutationen kooperiert, um die Gata2-Expression zu reduzieren. Dazu führten wir Competition-Assays mit elf Cebpa- mutierten Klonen, die eine heterozygote Gata2-Mutationen aufwiesen, durch und verwendeten CRISPRn und CRISPRi, um Mutation im – 77 kb Enhancer von Gata2 zu induzieren. Wir haben die Gata2-Expression mittels qPCR gemessen und ihren Effekt auf die Wachstumsrate bestimmt. Zusätzlich führten wir eine ChIP-qPCR an vier Tet2-Knockout- Klonen und vier Wildtyp-Klonen durch um zu untersuchen, ob die reduzierte Gata2- Expression das Ergebnis einer reduzierten Bindung von p30 an den – 77 kb Enhancer des GATA2 Gens nach einem TET2-Knockout ist. Wir fanden keine Korrelation zwischen Gata2- Expressionslevels und Proliferation in unseren Zelllinienmodellen. Da wir keinen Unterschied in der p30-Bindung in der Gata2- Genregion in ko-mutierten Zellen beobachten konnten, vermuten wir, dass die beiden Mutationen über einen anderen Mechanismus kooperieren.