Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2021

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021

Canine intestinal organoids are a great model to study human intestinal diseases because dogs develop similar gastrointestinal diseases as their owners. The cultivation of intestinal organoids needs the supplementation of Wnt3a to maintain the stemness of organoids. Wnt3a is water-insoluble and needs the addition of foetal bovine serum containing carrier proteins building the water-soluble active Wnt3a complex. However, for the clinical application in regenerative medicine it is not possible to use the organoids cultivated in medium supplemented with animal-derived products. Mihara and colleagues discovered that Wnt3a complexed to Afamin is hydrophilic and biologically active. This bachelor’s thesis was aimed at comparing the serum-free conditioned media containing Wnt3a produced by L-Wnt3a and HEK293T cells transfect with a piggyBac vector constitutively expressing Afamin and Wnt3a and the Super piggyBac transposase expression vector for lipid-mediated transient transfection of the cells. Wnt signalling activation and the effect on organoid viability, apoptosis and necrosis were assessed to evaluate the functionality of produced media. Results show that the integration of the plasmid coding for Afamin and Wnt3a was successful. However, it was not possible to activate the canonical Wnt pathway and to detect Wnt3a in the conditioned media. This leads to the assumption that the cells were unable to secret the Afamin-Wnt3a complex because of incorrect folding. Interestingly, all organoids survived a 28-day cultivation even though the medium was lacking Wnt3a. This could be explained by the presence of Paneth-like cells assuming the function of Wnt secretion in vitro.

Hunde entwickeln ähnliche gastrointestinale Erkrankungen wie ihre Besitzer und daher stellen canine intestinale Organoide ein geeignetes Modell dar, auch humane intestinale Krankheiten zu untersuchen. Um diese Organoide kultivieren zu können, ist es notwendig, dem Nährmedium Wnt3a zuzusetzen. Wnt3a ist ein wasserunlösliches Protein und kann nur durch Zusatz von fötalem Kälberserum und darin enthaltenen komplexbildenden Proteinen eine wasserlösliche aktive Form bilden. Für eine klinische Anwendung von Organoiden in der regenerativen Medizin ist allerdings die Verwendung von tierischen Produkten nicht zulässig. Miharas Arbeitsgruppe hat jedoch herausgefunden, dass durch eine Koexpression von Afamin und Wnt3a ein wasserlöslicher Komplex entsteht, der biologisch aktiv bleibt. Das Ziel dieser Bachelorarbeit bestand darin, serumfreies Wnt3a-beinhaltendes konditioniertes Medium zweier Zelllinien (L-Wnt3a und HEK293T) herzustellen und zu vergleichen. Für die Synthese von Afamin und Wnt3a wurde ein piggyBac Vektor gemeinsam mit einem Super piggyBac Transposase-Expressionsvektor verwendet, der unterstützend für die Lipofektion herangezogen wurde. Die Wnt-Signalaktivierung und die Auswirkungen auf die Viabilität, Apoptose und Nekrose der Organoide wurden untersucht, um die Funktionalität der hergestellten Medien bewerten zu können. Die Ergebnisse zeigen, dass die Integration des Plasmids gut funktioniert hat. Jedoch war es nicht möglich, Wnt3a Proteine in den konditionierten Medien nachzuweisen, um damit den kanonischen Wnt Signalweg zu aktivieren. Aufgrund dieser Ergebnisse kann vermutet werden, dass die Zellen nicht in der Lage waren, den Afamin-Wnt3a Komplex zu sekretieren, da wahrscheinlich das Protein aufgrund falscher Faltung zuvor abgebaut wurde. Interessanterweise blieben die kultivierten Organoide über den Beobachtungszeitraum von 28 Tagen, trotz nicht nachweisbaren Wnt3a, viabel. Diese Ergebnisse lassen deshalb vermuten, dass canine intestinale Organoide Paneth-ähnliche Zellen enthalten, die die Funktion der Wnt Sekretion in vitro übernehmen.

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