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Title (eng)
Solving technical issues to characterize porcine CD8alpha/beta expressing lymphocytes
Author
Florian Ringl
Assessor
Silvio Kau
Degree supervisor
Kerstin Mair
Description (eng)
Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023
Abstract (eng)
The CD8 molecule is a cell surface receptor and well described as co-receptor on T cells binding directly to the major histocompatibility complex class I on antigen presenting cells. CD8 antigens are comprised of two distinct polypeptide chains, the α and the β chain. In the pig, the CD8 receptor is expressed by several lymphocyte subsets, including Natural Killer cells, γδ T cells and antigen experienced CD4+ αβ T cells. On these cell populations CD8 is expressed as αα homodimer. Porcine cytolytic T cells on the other hand exclusively express CD8 αβ heterodimers. Several monoclonal antibodies (mAbs) for either of the two chains are available and are frequently used in flow cytometry. Previous results indicate that distinct combinations of mAb clones for CD8α and CD8β chains can cause troubles in multi-colour staining panels, possibly due to steric inhibition of the antibodies binding to spacial closely located epitopes. Therefore, aim of this project was the in-depth study of the usage of different CD8-specific mAb clones and optimizing co-staining strategies. For the experiments, peripheral blood mononuclear cells were isolated by gradient centrifugation from blood of healthy pigs obtained from a conventional slaughterhouse in Lower Austria. For flow cytometric analysis mAb clones 11/295/33 and 76-2-11 were used for the detection of CD8α and clones PPT23 and PG164A for the detection of CD8β. The results indicate that the CD8α clone 11/295/33 should not be used together with either of the two CD8β clones. It can be assumed, that the antibodies bind to spatially close epitopes on the CD8α and the CD8β chains. As a result, steric hindrance occurs, leading to a highly reduced ability of CD8β mAbs in binding their specific epitopes and loss in signal in flow cytometry. In case of the CD8α mAb clone 76-2-11, no inhibition of CD8β binding was observed. Therefore, we assumed that CD8α mAb clones 11/295/33 and 76-2-11 bind to different epitopes on the CD8α chain, that are distant from each other. This was confirmed in blocking experiments using both CD8α-specific mAb clones in combination where no effects on the staining intensities were observed. The obtained data will help in future panel designs for multi-colour flow cytometry in the pig and therefore improving studies of porcine immune cells.
Description (deu)
Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023
Abstract (deu)
Das CD8-Molekül ist ein Zelloberflächenrezeptor und in der Literatur als Korezeptor auf T Zellen beschrieben, der direkt an den Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I auf antigenpräsentierenden Zellen bindet. Für das CD8 Protein ist eine α- und eine β-Kette beschrieben. Beim Schwein wird der CD8-Rezeptor von mehreren Lymphozyten Populationen exprimiert, darunter Natürliche Killerzellen, γδ T-Zellen und Effektor/Gedächtnis CD4+ αβ T Zellen. Auf diesen Zellpopulationen wird CD8 als αα-Homodimer exprimiert. Zytolytische T Zellen vom Schwein hingegen exprimieren ausschließlich CD8 αβ-Heterodimere. Mehrere monoklonale Antikörper für beide Ketten sind verfügbar und werden häufig in der Durchflusszytometrie verwendet. Frühere Ergebnisse deuten darauf hin, dass unterschiedliche Kombinationen von Antikörperklonen für CD8α- und CD8β-Ketten zu Problemen bei mehrfarbigen Panels bei der Markierung von Zellen führen können. Dies ist möglicherweise auf eine sterische Hemmung bei der Bindung der Antikörper an räumlich nahe gelegene Epitope zurückzuführen. Ziel dieses Projekts war daher die eingehende Untersuchung der Verwendung verschiedener CD8-spezifischer monoklonaler Antikörperklone in Kombination und die Optimierung von Färbungsstrategien für die Durchflusszytometrie. Für die Experimente wurden periphere mononukleäre Blutzellen durch Gradientenzentrifugation aus dem Blut von gesunden Schweinen isoliert, die aus einem konventionellen Schlachthof in Niederösterreich stammten. Für die durchflusszytometrischen Analysen wurden die monoklonalen Antikörperklone 11/295/33 und 76 2-11 für den Nachweis von CD8α und die Klone PPT23 und PG164A für den Nachweis von CD8β verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass der CD8α-Klon 11/295/33 nicht zusammen mit einem der beiden CD8β-Klone verwendet werden sollte. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Antikörper an räumlich nahe beieinander liegende Epitope auf den CD8α- und CD8β-Ketten binden. Infolgedessen kommt es zu einer sterischen Behinderung, was zu einer stark reduzierten Fähigkeit der CD8β-bindenden monoklonalen Antikörper führt, ihre spezifischen Epitope zu binden. Dementsprechend kam es zu einem Signalverlust in der Durchflusszytometrie und einer suboptimalen Detektion der zytolytischen T-Zellen. Im Falle des CD8α Klons 76-2-11 wurde keine Hemmung der CD8β-Bindung beobachtet. Daher nahmen wir an, dass die CD8α-Klone 11/295/33 und 76-2-11 an unterschiedliche Epitope auf der CD8α Kette binden. Dies wurde in Blockierungsexperimenten bestätigt, bei denen beide CD8α-spezifischen monoklonale Antikörperklone in Kombination verwendet wurden - ohne Auswirkungen auf die Markierung. Die gewonnenen Daten werden bei der Gestaltung künftiger Panels für die Mehrfarben-Durchflusszytometrie beim Schwein hilfreich sein und somit die Untersuchung von Immunzellen beim Schwein verbessern.
Type (eng)
Bachelor theses
Language
[eng]
Persistent identifier
https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:4692
AC number
AC17217666
Number of pages
39
Date issued
2023
License
All rights reserved