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  1. PHAIDRA
  2. Detail o:3971
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Title (deu)
Gewinnung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus fetalen ovinen mesenchymalen Stammzellen und Chondrozyten mittels Hollow-Fiber-Bioreactor
eine Methodenetablierung
Author
Felix Braun
Assessor
Franziska Dengler
Degree supervisor
Iris Gerner
Degree supervisor
Florien Jenner
Description (deu)
Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023
Abstract (deu)
Neben der Möglichkeit Informationen durch direkten Zell-Zell-Kontakt auszutauschen, sind Zellen auch in der Lage durch die Abgabe von extrazellulären Vesikeln (EVs) miteinander zu kommunizieren. Wurden diese mit diverser molekularer Fracht (z.B. Proteine, Lipide und mRNA) beladenen membranumhüllten Vesikel zunächst als Störfaktoren in Diagrammen der Durchflusszytometrie betrachtet, änderte sich mit dem heutigen Wissen um ihre spezifischen Funktionen in der Zellkommunikation und dem Transport bioaktiver Moleküle die Einstellung der Wissenschaft gegenüber EVs grundlegend. Ihre Beteiligung an physiologischen wie auch pathologischen Prozessen, darunter auch die Entstehung einer Osteoarthrose, macht EVs zu potenziellen Kandidaten innerhalb der therapeutischen Intervention. Eine der größten Herausforderungen ist es, EVs in zu Forschungszwecken ausreichender Menge sowie in weiterer Folge zu Therapiezwecken (mit hohem Reinheitsgrad) zu produzieren. Limitierende Faktoren stellen dabei die klassischen Methoden der Zellkultur dar. Statt wie bisher, EVs durch die Verwendung zahlreicher Zellkulturflaschen, Medien, Personal und Zeit arbeitsintensiv und teuer zu produzieren, verspricht die Verwendung eines Bioreaktors deutlich größere Mengen an EVs bei kleinerem Arbeitsaufwand bereitzustellen. Ein Beispiel hierfür stellt ein sogenannter Hohlfaser-Bioreaktor dar. Durch das Vorliegen eines durch semipermeable Hohlfasern abgesonderten Kompartiments, dem sogenannten Extrazellulärraum, erfolgt eine kontrollierte Trennung zwischen zu kultivierenden Zellen und eingesetztem Medium. Über einen definierten Molekulargewichts-Cut-Off der Hohlfasern erhalten zu kultivierende Zellen Nährstoffe bestimmter Größe und geben Abfallprodukte wie Laktat und Ammoniak zurück ins Medium. Eine Anreicherung gebildeter EVs findet bei gleichzeitiger Abschirmung vor im Medium enthaltenen Serumbestandteilen statt. Der kapillare Aufbau erlaubt durch sein hohes Oberflächen-Volumen-Verhältnis die Kultivierung in hohen Zelldichten. Innerhalb der regenerativen Orthopädie stellen EVs aus mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Chondrozyten potenzielle Kandidaten zur zukünftigen Behandlung einer Osteoarthrose dar. Um EVs aus beiden genannten Zellen in ausreichenden Mengen produzieren zu können, bedarf es einer erfolgreichen Langzeitkultivierung im vorgestellten Hohlfaser-Bioreaktor. Diese Diplomarbeit ist Teil eines groß angelegten Projekts mit dem Ziel extrazelluläre Vesikel auf ihr Potential als Therapeutikum für die Behandlung von Osteoarthrose zu testen. Im Zuge dieser Arbeit soll die erfolgreiche Kultivierung fetaler oviner MSCs und Chondrozyten im Hohlfaser-Bioreaktor anhand spezifischer Parameter untersucht werden. Da in der Literatur noch keinerlei Referenzwerte bezüglich einer erfolgreichen Kultivierung genannter primärer Zellen im Bioreaktor vorliegen und um Versuchsergebnisse mit anderen Bioreaktor-erfahrenen Laboratorien (darunter die Partnerfirma Evercyte GmbH, Wien) vergleichen zu können, wurden vor Inbetriebnahme Vorversuche im Monolayer durchgeführt um den Effekt chemisch definierter serumfreier Medien hinsichtlich Phänotyp, metabolischer Aktivität, Zellproliferation und Glucoseverbauch der Zellen zu vergleichen. Entsprechend der erhobenen Ergebnisse, stellen MesenCultTM und NutriStemTM (zwei serumfreie Medien, die im Rahmen dieser Arbeit getestet wurden) zur Langzeitkultivierung von fetalen ovinen MSCs und Chondrozyten im Bioreaktor keine optimalen Medien dar, sodass die Inbetriebnahmen der Bioreaktoren mit institutserprobtem StemMACSTM MSC Expansion Media XF durchgeführt wurden. Erste Messungen des Glucoseverbrauchs sowie ein Anstieg von Laktat und Ammoniak im Medium deuten auf eine erfolgreiche Kultivierung im Bioreaktor hin. Parallel konnten erste EVKollektionen durchgeführt werden und deren Gehalt nach einer Querfiltration (Tangential- Flow-Filter) im Nanoparticle-Tracking-Analyzer bestimmt werden.
Description (eng)
Diploma thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023
Abstract (eng)
In addition to being able to exchange information through cell-cell contact directly, cells are also able to communicate with one another by releasing extracellular vesicles (EVs). While these membrane-enveloped vesicles, which are loaded with diverse molecular cargo (e.g. proteins, lipids and mRNA), were initially regarded as interfering factors in flow-cytometry diagrams, the scientific view of EVs has changed fundamentally with today´s knowledge of their specific functions in cell communication and the transport of bioactive molecules. Their involvement in both physiological and pathological processes makes EVs potential candidates for therapeutic intervention. However, major challenge in this field is to produce EVs in sufficient quantities for research purposes and subsequently for therapeutic purposes (with a high degree of purity). The limiting factors are the classic methods of cell culture. Instead of producing EVs in a labor-intensive and expensive manner which requires numerous cell culture flasks, huge amounts of media, and lots of personnel and time, the use of bioreactorsystems promise to provide significantly larger quantities of EVs with less work. An example of this is a so-called hollow-fiber bioreactor. The capillary structure of this bioreactor allows the cultivation of high cell numbers on the outer surface of the capillaries (Extracellular space (ECS)). The high surface-to volume ratio facilitates accumulation of high EV-numbers. At the same time the bioreactor provides shielding from “contamination” with serum compoments contained in the culture medium which is pumped through the hollow-fibres. Cells cultured in the ECS receive only nutrients of a certain size due to a defined molecular weight cut-off of the hollow fibers whose walls are built of semipermeable membranes. Waste products such as lactate and ammonia are returned into the medium. In regenerative orthopedics, EVs from mesenchymal stem cells and chondrocytes are potential candidates for future treatments of osteoarthrosis. In order to produce EVs from both of these two cell types in sufficient quantities for research purposes and later for therapeutic purposes, successful long-term cultivation in the hollow-fiber bioreactor is required. This diploma thesis is part of a large-scale project with the goal of producing extracellular vesicles in sufficient quantities. In the course of this work, the successful cultivation of fetal ovine MSCs and chondrocytes in the hollow-fiber bioreactor was investigated and optimized, because the literature does not yet offer any reference values for a successful cultivation of primary cells in the bioreactor. In addition we tested different culture conditions in order to be able to compare our results with results obtained by our the partnercompany (Evercyte GmbH, Vienna). According to our results, MesenCultTM and NutriStemsTM (two serum free media which were tested within the course of this thesis) do not qualify as optimal media for the long-term cultivation of fetal ovine MSCs und chondrocytes in the bioreactor. StemMACSTM MSC Expansion Media XF, which had been tested before was identified as best medium to be used. Measurements of the glucose consumption as well as the increase of lactate and ammonia in the medium indicate a successful cultivation in the bioreactor. At the same time, the first EV collections could be carried out and their concentration after cross-filtration (tangential flow filter) was measured in a nanoparticle tracking analyzer.
Type (eng)
Diplomarbeit
Language
[deu]
Persistent identifier
https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:3971
AC number
AC17385849
Number of pages
XIV, 91
Date issued
2023
License
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