Influence on ergosterol synthesis

Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023

Leishmaniais a genus of protozoan parasites that are transmitted to humans and animals through the bite of infected female sandflies. These parasites cause a disease called leishmaniasis. In the mammalianhostthe parasites are hidden from the immune system inhost macrophages. This makes pharmacological treatment of leishmaniasis difficult. Endoperoxides (EP) of natural and synthetic origin have been successfully used against malaria and in experimental models of leishmaniasis. A subgroup of EPs is derived from sterols with conjugated double bonds, such as ergosterol. So far, the influence of sterol endoperoxides on Leishmania viability and metabolism has not been studied in detail. This thesis was focused on the antileishmanial activity and mechanism of the two synthetic sterol EPs: ergosterol endoperoxide (ErgoEP) and dehydrocholesterol endoperoxide (DHCholEP). For this study the model system of Leishmania tarentolae promastigotes (LtP) was used. The experiments were performed to verify following hypotheses: (i) sterol EPs inhibit LtP viability, (ii) their mechanism of action in LtP involves the formation of radicals by reaction with Fe2+, (iii) their radical mediated damage is prevented by the radical scavenger N-acetyl cysteine (NAC), (iv) the enzymes of the Ergo synthesis pathway in Leishmania are most vulnerable due to the structure of sterol EPs which is similar to the enzymes’ substrates, (v) they cause mitochondrial inhibition. Experimentally, these ideas were addressed in chemical systems or in LtP using photometry, fluorometry and oximetry. Reactivity of EPs vs. Fe2+ was studied by complex formation of resulting Fe3+ with xylenol orange. The influence of sterol EPs and reference compounds on LtP was studied after 48 h incubation by resazurin fluorescence, yielding respective IC50 values. The shift of the IC50 values upon addition of NAC was studied to elucidate the role of radicals in their mode of action. The influence of sterol EPs on LtP respiration was evaluated in Oxoplates. After incubation of LtP with sterol EPs up to 48 h, subsequent saponification and solvent extraction, ergosterols were determined photometrically. The experiments revealed that sterol EPs react with Fe2+ forming Fe3+, suggesting radical formation. Sterol EPs inhibited LtP viability with IC50 values in the low micromolar range. Their activity was marginally influenced by NAC in LtP, pointing to a minor role of radical formation. Mitochondrial inhibition by sterol EPs in LtP was observed at concentrations only far beyond their IC50 range. In contrast, at concentrations around their IC50 sterol EPs strongly inhibited Ergo synthesis. These findings provide new experimental evidence that sterol EPs target the synthesis of Ergo in Leishmania and, therefore, could cause significant membrane disturbance.

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023

Leishmanien sind eine Gattung protozoischer Parasiten, die durch den Stich infizierter Sandmücken auf Menschen und Tiere übertragen werden. Die Parasiten verursachen eine Krankheit namens Leishmaniose. Endoperoxide (EP) wurden in experimentellen Modellen erfolgreich gegen Leishmaniose eingesetzt. Eine Untergruppe der EP leitet sich von Sterolen mit konjugierten Doppelbindungen, z. B. Ergosterol, ab. Bislang wurde der Einfluss von Sterol-EPs auf Leishmanien noch nicht eingehend untersucht. Diese Arbeit konzentrierte sich auf die antileishmanielle Aktivität und Mechanismus der beiden Sterol-EPs: Ergosterol-Endoperoxid (ErgoEP) und Dehydrocholesterol-Endoperoxid (DHCholEP). Für diese Studie wurde das Modellsystem Leishmania tarentolae promastigotes (LtP) verwendet. Folgende Hypothesen wurden überprüft: (i) Sterol-EPs hemmen die Lebensfähigkeit von LtP, (ii) ihr Wirkmechanismus in LtP beinhaltet die Bildung von Radikalen durch Reaktion mit Fe2+, (iii) ihre radikalvermittelte Schädigung wird durch den Radikalfänger N-Acetylcystein (NAC) verhindert, (iv) die Enzyme des Ergo-Syntheseweges in Leishmanien sind aufgrund der Struktur der Sterol-EPs, die den Substraten der Enzyme ähnlich sind, am anfälligsten. (v) sie verursachen eine mitochondriale Hemmung. Experimentell wurde die Reaktivität von EPs gegenüber Fe2+ wurde durch die Komplexbildung des resultierenden Fe3+ mit Xylenolorange untersucht. Der Einfluss von Sterol-EPs und Referenzverbindungen auf LtP wurde nach 48 h Inkubation anhand der Resazurin-Fluoreszenz untersucht, wobei die jeweiligen IC50-Werte ermittelt wurden. Die Verschiebung der IC50-Werte nach Zugabe von NAC wurde untersucht, um die Rolle von Radikalen in ihrer Wirkungsweise zu klären. Der Einfluss von Sterol-EPs auf die LtP-Atmung wurde in Oxoplatten untersucht. Nach bis zu 48 h Inkubation von LtP mit Sterol-EPs, anschließender Verseifung und Extraktion wurden die Ergosterole photometrisch bestimmt. Die Versuche zeigten, dass Sterol-EPs mit Fe2+ unter Bildung von Fe3+ reagieren, was auf eine Radikalbildung schließen lässt. Sterol-EPs hemmten die Lebensfähigkeit von LtP mit IC50-Werten im niedrigen mikromolaren Bereich. Ihre Aktivität wurde durch NAC in LtP nur geringfügig beeinflusst, was auf eine untergeordnete Rolle der Radikalbildung hindeutet. Die mitochondriale Hemmung durch Sterol-EPs in LtP wurde nur weit jenseits ihres IC50-Konzentrationsbereichs beobachtet. Im Gegensatz dazu hemmten Sterol-EPs die Ergo-Synthese bei Konzentrationen um ihren IC50-Wert. Diese Ergebnisse liefern neue experimentelle Beweise dafür, dass Sterol-EPs auf die Ergo-Synthese in Leishmanien abzielen und daher erhebliche Membranstörungen verursachen könnten.

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