Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2024

Die Kapazitation von Spermien ist ein wichtiger Reifungsprozess, welche für die Befruchtungsfähigkeit unerlässlich ist. Im Zuge der Kapazitation kommt es zu physiologischen und biochemischen Veränderungen am Spermium. Calcium und Bicarbonat strömen in die Zelle ein, Cholesterol strömt aus der Membran aus, die molekulare Zusammensetzung der Spermienmembran ändert sich und Proteine im Spermium werden phosphoryliert. Außerdem entwickeln die Spermien eine hyperaktivierte Bewegung. Zum Nachweis der Kapazitation beim Hund wird derzeit vor allem der Chlortetrazyklinassay verwendet, hierbei wird Calcium im Spermium angefärbt und charakteristische Färbemuster entstehen. Eine neuere Nachweismethode stellt die Tyrosinphosphorylierung dar, hierbei wird mittels fluoreszierender Antikörper dargestellt, wie Proteine während der Kapazitation verändert werden. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden ein Vergleich dieser beiden Nachweisverfahren vorgenommen. Die spermienreiche Phase aus dem Ejakulat gesunder Rüden wurde auf 100 x 106 Spermien/mL verdünnt und Anteile davon entnommen zur Prüfung der Membranintegrität und Bestimmung der kinematischen Daten, sowie jeweils für den CTC-Assay und die Tyrosinphosphorylierung. Die jeweiligen Verfahren wurden nach einer Inkubationszeit von einer Stunde durchgeführt und anschließend die Ergebnisse miteinander verglichen. Zum Zeitpunkt der Beurteilung zeigten sich beim CTC-Assay 54,2 % ± 17,1 % der untersuchten Spermien als kapazitiert. Bei der Tyrosinphosphorylierung war ein Prozentsatz von 18,7 % ± 25,4 % der Spermien phosphoryliert (p = 0,075). Zwischen den unkapazitierten Spermien war ein signifikanter Unterschied erkennbar (p = 0,028). Im Rahmen der Beurteilung bestätigte sich die Hypothese, dass die Ergebnisse nicht direkt vergleichbar sind, da mit den verschiedenen Verfahren unterschiedliche Vorgänge in den Spermien dargestellt werden, welche zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kapazitation stattfinden.

Capacitation is an important spermatozoa maturation process and essential for fertilization. During capacitation, physiological and biochemical changes occur in the cell. Calcium and bicarbonate flow into the cell, cholesterol is transported through and out of the sperm membrane, the molecular composition of the sperm membrane changes and sperm proteins are phosphorylated. The chlortetracycline (CTC) assay is a frequently used method to detect capacitation in canine spermatozoa. Within this method, intracellular calcium binds chlortetracycline, resulting in characteristic staining patterns. Another method for determining the capacitation state of sperm is the tyrosine phoshporylation assay. This method uses fluorescent antibodies to indicate modification of location of a special membrane protein during capacitation. The aim of this study was to compare these two methods. The sperm-rich phase from the ejaculate of healthy male dogs was diluted to 100 x 106 sperm/mL and aliquots were taken for determining membrane integrity and kinematic data, as well as for the chlortetracycline assay and tyrosine phosphorylation. The different methods were performed after an incubation period of one hour, then the results were compared. At the time of assessment, the CTC assay showed 54.2 % ± 17.1 % of capacitated sperm, whereas with tyrosine phosphorylation assay, a percentage of 18.7 % ± 25.4 % of cells was phosphorylated (p = 0.075). A significant difference was seen between the uncapacitated spermatozoa (p = 0.028). During the assessment, it became apparent that the hypothesis was true and results are not directly comparable, since the different methods evaluate different processes during capacitation occuring at different time points of capacitation.

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28 Blätter