Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2022

Equine Sarkoide sind die häufigsten Hauttumoren bei Pferden und werden durch eine Infektion mit BPV1 und/oder BPV2 ausgelöst. Vorangegangene Studien haben eine geografische Prä-valenz in Bezug auf den vorherrschenden BPV-Typ gezeigt. Der Verlauf der Erkrankung ist variabel und reicht von einzelnen kleinen schuppigen Bereichen bis hin zu großflächigen Haut-veränderungen mit progressivem Charakter. Auch wenn die Ätiologie der Sarkoide bereits bekannt ist, so sind wichtige Faktoren für die Entwicklung einer effektiven Therapie und Prophylaxe, wie z.B. die Übertragung der Viren, Lebenszyklus etc., bis heute teils ungeklärt. Die bisherige Forschung befasste sich aufgrund der großen genetischen Ähnlichkeit von BPV1 und BPV2 bislang nur mit dem Nachweis von einem der beiden Typen. Die dabei verwendeten Methoden lassen die Vermutung zu, dass das zeitgleiche Vorkommen des anderen BPV-Typs verschleiert wurde. Eine zeitgleiche Infektion mit BPV1 und BPV2 wurde zum Zeitpunkt der Entstehung dieser Arbeit nur einmal als Zufallsergebnis beschrieben. Ziel dieser Arbeit war einerseits ein geeignetes Testverfahren für den spezifischen Nachweis der beiden Typen zu generieren und andererseits, bei erfolgreicher Detektion von Doppelinfektionen, jene im Kontext des Krankheitsverlaufes auf Kausalitätszusammenhänge zu analysieren. Dafür wurden von 67 Pferden Proben von Sarkoidgewebe ausgewählt und zu drei Schwere-grade des Krankheitsverlaufes (geringgradig, mittelgradig, hochgradig) zugeordnet. Jede Probe wurde unter dem Einsatz von BPV-typspezifischen Primern mittels qualitativer PCR getestet. Neun Sarkoidproben wurden anschließend mittels quantitativer PCR analysiert. Zur Validierung des Testsystems wurde eine zusätzliche quantitative PCR der Plasmid-Standards und eine digitale PCR zur Ermittlung der genauen Konzentration dieser Standards durchgeführt. Bei der quantitativen PCR wurden zur Berechnung der BPV-DNS Kopien pro Zelle zeit-gleich auf equines LHB getestet. Die Proben der Kühe aus Bristol wurden bereits zuvor mittels qualitativer PCR getestet und in dieser Arbeit nur mit quantitativer PCR auf das Vorhandensein von BPV 1/2 DNS untersucht. Bei den Kühen konnte nur BPV1 DNS mittels quantitativer PCR nachgewiesen werden. Für BPV2 konnten zwar Signale generiert werden, jedoch zeigten sie bei der grafischen Analyse keine Ähnlichkeit zum Verlauf der Standards. Bei den Sarkoidproben konnten mittels qualitativer PCR insgesamt zwei Doppelinfektionen nachgewiesen werden, die den Kategorien "geringgradige -" bzw. "hochgradige Erkrankung" zugeordnet werden konnten. Zwei weitere Proben wiesen eine BPV2-Infektion auf. Mittels quantitativer PCR wurde das simultane Vorhandensein von BPV1- und BPV2-DNS bei den zwei Proben bestätigt und lieferte zusätzlich den Nachweis auf zwei weitere Doppelinfektionen, die mittels qualitativer PCR nicht erkannt wurden. Insgesamt konnten mit der quantitativen PCR vier Koinfektionen detektiert werden, wobei drei davon mit einem schweren Krankheitsverlauf korrelierten. Somit lieferte diese Studie erstmalig den Nachweis für einen möglich-erweise prognostischen Parameter in Bezug auf den Krankheitsverlauf. Die ermittelte unter-schiedliche Verteilung der Viruslast lässt eine Vielzahl von Vermutungen zur Beteiligung der einzelnen Virustypen am Krankheitsprozess zu und könnte ein vielversprechendes zukünftiges Forschungsgebiet sein.

The equine sarcoid is the most common skin tumor in horses and is induced by infection with BPV1 and/or BPV2. Previous studies have shown that there is a geographical prevalence in relation to the dominant BPV-type. The course of the disease is variable and ranges from single small scaly areas to extensive skin changes with progressive character. Although the etiology of sarcoids is already known, important information needed for the development of effective therapeutics and prophylactic vaccines, such as the transmission of the viruses, their exact life cycle in horses, etc., are still lacking. Due to the high genetic similarity of BPV1 and BPV2, the current research has only focused on the detection of one of the two types. The methods used so far allow the assumption, that the simultaneous occurrence of the other BPV type has remained concealed. At the time of writing, a simultaneous infection of sarcoid-affected horses with BPV1 and BPV2 has only been described once as a random result. The aim of this work was on the one hand to generate a highly sensitive PCR-based procedure for the specific and simultaneous quantitative detection of BPV1 and BPV2, and on the other hand, in the case of successful detection of double infections, to analyze these in relation to severity of sarcoid disease. For this purpose, samples of sarcoid tissue from 67 horses were selected and assigned to three severity levels of disease progression (low-grade, intermediate-grade, high-grade). Each sample was tested by qualitative PCR using BPV type-specific primers. Nine sarcoid samples were subsequently analyzed by quantitative PCR. Additional quantitative PCR of the plasmid standards and digital PCR to determine the exact concentration of these standards were performed to validate the test system. In quantitative PCR, equine LHB was tested simultaneously to calculate BPV DNA copies per cell. The samples from the Bristol cows were previously tested by qualitative BPV1/2 PCR and thus only analyzed by quantitative PCR for the presence of BPV 1/2 DNA in this work. Only BPV1 DNA could be detected in the bovine warts by quantitative PCR. For BPV2, signals were obtained but didn't yield a clearly positive result, as revealed by curve analyses. In sarcoids, a total of two double infections were detected by qualitative PCR and could be assigned to the categories "mild disease" and "severe disease". Two further samples tested exclusively BPV2-positive by this method. Quantitative PCR confirmed the simultaneous presence of BPV1 and BPV2 DNS in the two samples mentioned above and also provided evidence of two additional double infections that were not detectable by qualitative PCR. In total, four coinfections were detected by quantitative PCR, with 3/4 coinciding with severe disease. This is the first study providing evidence of BPV1/2 coinfection possibly constituting a prognostic parameter in sarcoid disease. The different distribution of respective viral DNA loads in coinfected sarcoids gives rise to a variety of speculations regarding the involvement of the individual BPV types in disease development and progression. Hence, further research should be conducted in this field.

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