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Phenotypical and functional characterization of porcine Th17 lymphocytes
Jessica Lange
Kerstin Mair
Andrea Hölbl-Kovacic
Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020
CD4+ T-helper cells play an important role in the adaptive immune response. Naïve CD4+ cells can differentiate into differently specialized effector subsets upon activation. One of those subsets are the Th17 cells that are involved in the protection against extracellular bacteria and fungi and play a role in inflammatory responses. They are characterized by the production of IL-17A, the expression of the transcription factor RORγt and the chemokine receptor CCR6. In pigs, IL-17A producing CD4+ T cells were identified. However, no further markers are available for a more detailed characterization of porcine Th17 cells. Aim of this study was therefore the validation of markers that can be used for a better characterization of porcine Th17 cells. As currently no species-specific mAbs against RORγt and CCR6 are available, potential cross-reactive anti-human/mouse mAbs directed against the two markers were tested in FCM on porcine PBMC. The anti-RORγt mAb clone AFKJS-9 showed a distinct staining on porcine lymphocytes ex vivo that also correlated with CD4 expression. Furthermore, a CD4+IL-17A+RORγtdim population was observed after stimulation of cells with PMA/Ionomycin. The anti-CCR6 mAb clone G034E3 was likewise tested on porcine PBMC ex vivo and after stimulation. Only a weak staining could be seen with this antibody without clear co-expression of CD4 and IL-17A. Recombinant porcine proteins of both RORγt and CCR6 were generated for cross-reactivity proof of the mAb candidates. Working steps for this test included amplifying RORγt and CCR6 by PCR with gene-specific primers and cloning them into separate mammalian expression vectors containing a FLAG sequence. In a last step, HEK293T cells were transiently transfected with the expression vectors and the transfectants were analyzed in FCM with the potential cross- reactive mAbs and a commercially available mAb against the FLAG-tag as control. For RORγt a clear signal was visible, indicating that the mAb is indeed cross reactive. A missing signal for the FLAG-tag was explained by an internal stop-codon upstream of the FLAG sequence. For the CCR6 transfectants on the other hand, no specific stainings for the cross-reactivity candidate as well as the FLAG control were observed. As sequencing of the tested expression vector did not reveal any mutations the failed expression of the recombinant protein cannot be explained at the moment. Therefore, no final statement about the CCR6 cross-reactivity can be made at this time point, and the experiments need to be repeated.
Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020
CD4+ T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle für das adaptive Immunsystem. Naive CD4+ Zellen können nach Aktivierung in verschiedene spezialisierte Effektor-Zelltypen differenzieren. Eine dieser Effektor Subpopulationen sind die Th17 Zellen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Immunantwort gegen extrazelluläre Bakterien und sind in Entzündungsreaktionen involviert. Th17 Zellen sind charakterisiert durch die Produktion von IL-17A und die Expression des Transkriptionsfaktors RORγt und des Chemokinrezeptors CCR6. Bei Schweinen ist jedoch nur wenig über Th17 Zellen bekannt. Es wurden IL-17A produzierende CD4+ Zellen im Schwein gefunden, jedoch fehlen bis heute zusätzliche Marker für eine bessere Charakterisierung der porzinen Th17 Zellen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, zusätzliche Marker zur Th17 Charakterisierung zu testen. Da es bis jetzt keine spezies-spezifischen monoklonalen Antikörper (mAk) für RORγt und CCR6 im Schwein gibt, wurden potenziell kreuzreaktive anti-Human/-Maus Antikörper getestet. Dies wurde mittels Mehrfarben-Durchflusszytometrie auf porzinen mononukleären Blutzellen getestet. Mit dem anti-RORγt mAk Klon AFKJS-9 konnte ein eindeutiges Signal auf porzinen Lymphozyten gezeigt werden und eine Koexpression mit CD4. Zusätzlich konnte eine Population von CD4+IL-17A+RORγtdim Zellen nach PMA/Ionomycin Stimulation identifiziert werden. Der anti-CCR6 mAk Klon G034E3 zeigte aber nur ein sehr schwaches Signal auf porzinen Zellen und es konnte auch keine Koexpression mit CD4 und IL-17A gezeigt werden. Für den Beweis der Kreuzreaktivität der Antikörper wurden rekombinante porzine Proteine von RORγt und CCR6 erstellt. Dazu wurden die mRNA Sequenzen mittels PCR mit gen- spezifischen Primern amplifiziert und in Expressionsvektoren für Säugetierzellen kloniert. Diese Vektoren enthielten zusätzlich eine FLAG Sequenz. HEK293T Zellen wurden mit den Vektorkonstrukten transient transfiziert und die Zellen in der Durchflusszytometrie analysiert. Hierfür wurde der zu testende mAk in Kombination mit einem FLAG-spezifischem mAk als Kontrollmarkierung verwendet. Für RORγt war ein klares positives Signal sichtbar, was für die Kreuzreaktivität des Antikörpers spricht. Das fehlende FLAG Signal konnte nach der Sequenzierung auf ein internes Stop-Codon vor der FLAG Sequenz zurückgeführt werden, wodurch es zum verfrühten Abbruch der Translation kam. Bei den CCR6 Transfektanten konnten nur unspezifische Signale mit dem anti-CCR6 mAk, aber auch der FLAG-Kontrolle gesehen werden. Die Sequenzierung des Expressionsvektors konnte keine Erklärung liefern, wieso der FLAG-tag nicht exprimiert wurde, da keine Veränderungen in der Sequenz gefunden wurden. Daher können zum jetzigen Zeitpunkt keine finalen Aussagen zu der CCR6 Kreuzreaktivität gemacht werden und eine Wiederholung der Experimente ist als nächster Schritt geplant.
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2020
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