Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2022

Heme oxygenase (HO) is an integral enzyme of the stress response of the cell, iron homeostasis and anti-oxidant defense. HO oxidatively cleaves heme, degrading it into biliverdin (BV), ferrous iron and carbon monoxide (CO), which promote the anti-inflammatory, anti-oxidant, and antiapoptotic effects of HO. However, due to HO’s release of iron, it’s involvement in ferroptosis is being questioned and may limit its pro-survival function. Ferroptosis is form of non-apoptotic regulated cell death dependent on iron. It can be induced by an overload of iron in the cell, which leads to lipid peroxidation and an accumulation of lethal reactive oxygen species (ROS). ROS fulfil important signaling function, however, when in excess they cause oxidative stress, oxidatively damaging the cells organelles and membranes, and induce programmed cell death. Ferroptosis can be induced by small molecules, such as erastin and RSL3, which can interfere with the cell’s capacity to counteract lipid peroxidation. Erastin induces ferroptosis by inhibiting cystine importing system Xc-, and thereby GSH synthesis, which reduces the cellular ability to handle oxidative stress. GSH is required for GPX4 activity, an anti-oxidant enzyme, which repairs lipid peroxides. RSL3 directly inhibits GPX4, and thus increases lipid peroxidation in the cell, resulting in ferroptotic cell death. It was the aim of this study to investigate the effect of HO function on ferroptosis in human bone marrow mesenchymal stromal cells (hBMSCs) (undifferentiated cells) and osteoblast-like cells (differentiated cells), which particularly depend on iron. Since differentiation state of osteoblast-like cells may also play a role in ferroptosis, both, adherently growing undifferentiated and differentiated cells were used. Cells were treated with erastin and RSL3, and in parallel with hemin and zinc protoporphyrin IX (ZnPP) for inhibiting and increasing HO activity respectively. To test whether the cell death was resulting from ferroptosis, ferrostatin-1 (FS) was added, together with ferroptosis inducers and HO modulators. As indicator of cell death, protein content of the cell mass present at the end of the experiment was determined using the Bradford method. HO activity of homogenated cells was measured using a coupled photospectroscopic biochemical assay. Undifferentiated cells displayed only a weak, differentiated cells no sensitivity at all against erastin. However, RSL3 exerted ferroptosis in cells of both differentiation state, with undifferentiated cells being more sensitive. ZnPP prevented ferroptosis induction at least partially in RSL3 treated undifferentiated cells, and fully rescued differentiated cells. Co-treatment with FS resulted in complete protection of undifferentiated cells treated with ZnPP and RSL3, indicating at least partial contribution of HO products to ferroptotic death of undifferentiated cells. Contrary to our expectation, heme did not increase ferroptosis rate upon RSL3 challenge, which indicates upregulation of multiple cytoprotective pathways, possibly involving BACH. This all suggests that HO activity is supporting ferroptosis in hBMSCs and osteoblast-like cells due to release of iron, and that undifferentiated cells are more sensitive towards those effects. Hemin treatment, however, appears to be no suitable approach for enhancing ferroptosis.

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2022

Häm-Oxygenase (HO) ist ein integrales Zellenzym, beteiligt an der Stressreaktion der Zelle, der Eisenhomöostase und der anti-oxidativen Abwehr. HO spaltet Häm oxidativ in Biliverdin (BV), Eisen und Kohlenmonoxid (CO), welche die entzündungshemmende, anti-oxidative und anti-apoptotische Wirkung von HO vermitteln. Da HO Eisen freisetzt könnte seine anti-apoptotische Funktion eingeschränkt werden, weshalb seine Beteiligung an der Ferroptose in Frage gestellt. Ferroptose ist eine eisenabhängige Form des nicht-apoptotischen, regulierten Zelltods. Sie kann durch eine Überladung der Zelle mit Eisen ausgelöst werden, was zu Lipidperoxidation und einer Anhäufung von letalen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt. ROS haben eine wichtige Signalfunktion, verursachen jedoch im Übermaß oxidativen Stress, der die Zellorganellen und -membranen oxidativ schädigt und den programmierten Zelltod auslöst. Die Ferroptose kann durch kleine Moleküle wie Erastin und RSL3 ausgelöst werden, die die Fähigkeit der Zelle, der Lipidperoxidation entgegenzuwirken, beeinträchtigen können. Erastin löst die Ferroptose aus, indem es das Cystin-Import-System Xc- und damit die GSH-Synthese hemmt, wodurch die Fähigkeit der Zelle, oxidativen Stress zu bewältigen, verringert wird. GSH ist für die Aktivität von GPX4 erforderlich, einem anti-oxidativen Enzym, das Lipidperoxide repariert. RSL3 hemmt GPX4 direkt und erhöht so die Lipidperoxidation in der Zelle, was zum ferroptotischen Zelltod führt. Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen der HO-Funktion auf die Ferroptose in Knochenmarkszellen wie human bone marrow mesenchymal stromal cells (hBMSCs) (undifferenzierte Zellen) und osteoblast-like cells (differenzierte Zellen), die besonders eisenabhängig sind, zu untersuchen. Da der Differenzierungsgrad der Knochenmarkszellen eine Rolle bei der Ferroptose spielen könnte, wurden von adhärent wachsenden Zellen sowohl undifferenzierte als auch differenzierte Zellen verwendet. Die Zellen wurden mit Erastin oder RSL3 behandelt, mit Zusatz von Hemin oder Zinkprotoporphyrin IX (ZnPP), um die HO-Aktivität zu hemmen bzw. zu erhöhen. Um zu prüfen, ob der ausgelöste Zelltod auf Ferroptose zurückzuführen ist, wurde Ferrostatin-1 (FS) zu den Ferroptose-Induktoren und HO-Modulatoren hinzugefügt. Als Indikator für den Zelltod wurde der Proteingehalt, der am Ende des Experiments vorhandenen Zellmasse mit der Bradford-Methode bestimmt. Die HO-Aktivität der homogenisierten Zellen wurde mit einem gekoppelten photospektroskopischen biochemischen Test gemessen. Undifferenzierte Zellen zeigten nur eine geringe, differenzierte Zelle überhaupt keine Empfindlichkeit gegenüber Erastin. RSL3 jedoch bewirkte Ferroptose in Zellen beider Differenzierungsstadien, wobei undifferenzierte Zellen empfindlicher waren. ZnPP verhinderte die Ferroptose-Induktion zumindest teilweise in mit RSL3 behandelten undifferenzierten Zellen und rettete differenzierte Zellen vollständig. Die gleichzeitige Behandlung mit FS führte zu einem vollständigen Schutz undifferenzierter Zellen, die mit ZnPP und RSL3 behandelt wurden, was auf einen zumindest teilweisen Beitrag von HO-Produkten zum ferroptotischen Zelltod undifferenzierter Zellen hinweist. Entgegen unserer Erwartung erhöhte Hemin die Ferroptose-rate nach einer RSL3-Behandlung nicht, was auf eine Hochregulierung mehrerer zytoprotektiver Signalwege hinweist, möglicherweise unter Beteiligung von BACH. Das alles deutet darauf hin, dass die HO-Aktivität Ferroptose in hBMSCs und osteoblast-like cells durch die Freisetzung von Eisen unterstützt und dass undifferenzierte Zellen empfindlicher auf diese Effekte reagieren. Die Behandlung mit Hemin scheint jedoch kein geeigneter Ansatz zur Förderung der Ferroptose zu sein.

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VII, 62 Blätter