Diplomarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2019

Immunglobulin E (IgE) mediiert Typ I-Hypersensitivitätsreaktionen und spielt eine Rolle in der initialen Immunantwort auf Parasiten. Speziell für die Untersuchung und Charakterisierung von Hypersensitivitätsreaktionen vom Typ I werden spezifische Antikörper gegen porcines IgE (pIgE) benötigt. Das Schwein ist für solche Fragestellungen ein gefragter Modellorganismus, was jedoch durch die geringe Verfügbarkeit monoklonaler Antikörper (mAb) gegen pIgE erschwert wird. Sowohl in der Human-, als auch in der Veternärimmunologie besteht schon lange das Bestreben, monoklonale Antikörper (monoclonal antibodies, mAb) gegen pIgE herzustellen und verfügbar zu machen. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden monoklonale Antikörper gegen pIgE hergestellt und charakterisiert. Dafür wurden BALB/c-Mäuse mit einem rekombinanten Konstrukt der schweren Kette des pIgE-Moleküls (CH2-CH4) in der Größe von etwa 50 kDa, versehen mit einem 6xHIS-Tag (HIS-IgE), immunisiert. Milz-Lymphozyten dieser Mäuse wurden mit murinen Myelomzellen fusioniert und die Hybridome kultiviert. Die Klone, die anti-pIgE produzierten, wurden durch ein Durchflusszytometrie-basiertes Screeningverfahren ermittelt, wobei die mAb bei einem Screen auf HEK 293T-Zellen, die intrazellulär die mit einem FLAG®-Tag versehene schwere Kette (CH2-CH4) exprimierten (FLAG®-pIgE), auf ihre Spezifität untersucht wurden. Die gewonnenen Antikörper wurden mithilfe von in je fünf Aminosäuren überlappenden 15-mer-Peptiden (entsprechend der pIgE-Sequenz) im ELISA weiter charakterisiert, um das von den mAb erkannte Epitop genau definieren zu können. Dieselben 15-mer-Peptide wurden auch in einem Blocking-Assay in der Durchflusszytometrie auf FLAG®-IgE HEK 293T-Zellen verwendet. Eine etwaige Kreuzreaktivität mit anderen porcinen Immunglobulinen wurde im ELISA überprüft. Es wurden vier monoklonale Antikörper gewonnen, die pIgE spezifisch erkannten. Bei drei Antikörpern handelte es sich um den Isotyp IgG1, bei einem weiteren um IgM. Zwei der IgG1-mAb erkannten dasselbe Epitop. Es konnte keine Kreuzreaktivität mit porcinem IgG oder IgM festgestellt werden, und das Immunogen ist mittels der drei hergestellten mAb des Isotyps IgG1 präzipitierbar. Die so hergestellten monoklonalen Antikörper haben das Potential, für diverse immunologische Standardverfahren Verwendung zu finden und könnten somit dazu beitragen, dass das Schwein als Großtiermodell in der Allergieforschung etabliert und genutzt wird.

Immunoglobuline E is the primary mediator of type I hypersensitivity and is involved in the initial immune response to parasites. In order to examine and further characterize type I hypersensitivity reactions, monoclonal antibodies against porcine IgE (pIgE) are an essential tool in research and diagnostics. There is huge interest in using pigs as large animal models for allergic diseases. The lack of specific antibodies against pIgE, however, limits their application currently. Generating monoclonal antibodies (mAb) directed against pIgE has been a long lasting effort in veterinary as well as human immunology and allergology. The subject of this thesis was the production and characterization of mAb against pIgE. For this purpose, BALB/c mice were immunized with 6xHIS-tagged recombinant porcine IgE heavy chain (CH2-CH4; HIS-IgE) of about 50 kDa. Splenic lymphocytes of immunized mice were fused with murine myeloma cells. Clones producing mAb were screened on HEK 293T cells expressing intracellular FLAG®-tagged pIgE heavy chain (CH2-CH4; FLAG®-IgE) by flow cytometry (FCM) for specificity. Specific mAb were further characterized by ELISA with 32 15-mere peptides, overlapping in five amino acids created of the respective pIgE sequence in order to figure out the recognized epitope. The same peptides were also used in blocking assays on FLAG®-IgE expressing HEK 293T cells by FCM. Cross-reactivity with other porcine immunoglobulins was tested by ELISA. This attempt resulted in the generation of four monoclonal antibodies, three of which were classified as IgG1, the fourth as IgM. Two of the IgG1 antibodies recognized the same epitope. No cross reactivity with porcine IgG or IgM was detected. The three IgG1-mAb are capable of precipitating the immunogen. These monoclonal antibodies have potential to be used for various immunological methods and could prove as a valuable tool for research in allergy and atopy. They might constitute an important factor in the establishment and use of swine as a large animal model for hypersensitivity reactions.

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