o:875 Loss of the neuronal nuclear protein in oriens lacunosum moleculare interneurons in the ventral hippocampus of mice en Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2021 Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021 In the brain, the hippocampus plays an important role in memory formation and it is closely tied to emotion. The control of the input and distribution of excitatory signaling in neuronal circuits is essential and regulators like the oriens lacosum moleculare cells are therefore crucial. A genetically defined population are the oriens lacosum moleculare cells that express an ɑ2 subunit in nicotinergic acetylcholine receptors. To investigate their role in mice, this subunit can be downregulated and observations of the resulting effects can be made. In this pilot study, the neuronal nuclear protein was targeted instead of the Chrna2, to find the optimal parameters and validate the methods. This protein is abundantly expressed in most neurons and therefore, a good control of downregulation. To lower the protein levels, a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 system was used to knockout the Rbfox3 gene corresponding to the neuronal nuclear protein. A mouse strain crossbreed expressed the Cas9 protein in the cells expressing the ɑ2 subunit and the small guiding RNA was delivered by an adeno-associated virus. To observe the virus, it also expressed the mCherry fluorescent protein. After the injection, the mouse brains were sectioned and stained immunohistochemically to visualize the oriens lacosum moleculare cells with the ɑ2 subunit and the neuronal nuclear protein. Using a widefield and confocal microscope, the sections were imaged and analyzed. In this study, the methods that provided the best results for the analysis were defined, as well as the optimal injection volume of the virus for the target area. The neuronal nuclear protein expression could be confirmed in 84 % of the oriens lacosum moleculare cells with the ɑ2 subunit, which was lowered to 49 % in the cells infected by the virus. This means, that the knockout was successful and therefore the Cas9 protein is functional in this setup. Specifically, these findings can be used in future behavioral studies when downregulating the ɑ2 subunit in nicotinergic acetylcholine receptors to address the effect of the inhibition of oriens lacosum moleculare cells in an anxiogenic context. Im Gehirn spielt der Hippocampus eine wichtige Rolle beim Gedächtnis und er ist eng mit Emotionen verbunden. Die Kontrolle der eingehenden exzitatorischen Signale und deren Verteilung ist in neuronalen Schaltkreisen ist essentiell, und Regulatoren wie die oriens lacosum moleculare-Zellen sind daher wesentlich. Eine genetisch definierte Population sind die oriens lacosum moleculare-Zellen, die eine α2 Untereinheit in nikotinischen Acetylcholinrezeptoren exprimieren. Um ihre Rolle in Mäusen zu untersuchen, kann die α2- Untereinheit herunterreguliert und die daraus resultierenden Effekte beobachtet werden. In dieser Pilotstudie wurde das NeuN Protein anstelle der α2-Untereinheit anvisiert, um die Methoden zu validieren. Das NeuN Protein wird in den meisten Neuronen abundant exprimiert und ist daher eine gute Kontrolle für die Herunterregulierung. Um die Proteinkonzentrationen zu senken, wurde ein „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“/Cas9-System verwendet, das das Rbfox3-Gen ausschaltet, welches für das NeuN Protein kodiert. Eine Mausstammkreuzung exprimierte das Cas9-Protein in den Zellen, die die α2-Untereinheit exprimieren. Eine „small guiding“ RNA wurde von einem adeno-assoziiertem Virus geliefert. Um das Virus zu beobachten, exprimierte es auch das mCherry-Fluoreszenzprotein. Nach der Injektion wurden die Mäusegehirne geschnitten und immunhistochemisch gefärbt, um die oriens lacosum moleculare-Zellen mit der α2 Untereinheit und das neuronale Nuclearprotein zu visualisieren. Mit Hilfe eines Weitfeld- und eines konfokalen Mikroskops wurden die Schnitte untersucht und ausgewertet. In dieser Studie wurden die Methoden definiert, die die besten Ergebnisse für die Analyse lieferten, sowie das optimale Injektionsvolumen des Virus. Die NeuN Proteinexpression konnte in 84 % der oriens lacosum moleculare-Zellen mit der α2 Untereinheit nachgewiesen werden. In den Zellen, die mit dem Virus infiziert waren, wurde das Level auf 49 % gesenkt. Folglich war der Knockout erfolgreich und das Cas9-Protein ist in diesem System funktional. Konkret können diese Resultate in zukünftigen Verhaltensstudien verwendet werden, wenn die α2 Untereinheit in nikotinischen Acetylcholinrezeptoren herunterreguliert werden soll, um die Wirkung der Hemmung von oriens lacosum moleculare-Zellen in einem anxiogenen Kontext zu untersuchen. 1552151 AC16362221 2021-11-12T12:03:02.042Z 44 no 46 Claudia Amort 1552167 Rudolf Moldzio 1552167 Klas Kullander 1552167 Angelica Thulin 1562799 Alois Strasser application/pdf 1230454 https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:875 no yes 1 70 1738 2021 50 Blätter 2021