https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:4725 Blocking antigen-presenting cell/T cell interaction by monoclonal antibodies Bargehr, Thomas Thomas Bargehr Kau-Strebinger, Silvio Silvio Kau-Strebinger Mair, Kerstin Kerstin Mair text eng Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2024 Während der Aktivierung des adaptiven Immunsystems kommen Antigen-präsentierende Zellen in Kontakt mit T und B-Zellen. Sie bilden die immunologische Synapse, in welcher Antigen erkennende Moleküle, kostimulierende Moleküle und Adhäsionsmoleküle eine wichtige Rolle spielen. Adhäsionsmoleküle führen die zwei involvierten Zellen näher zueinander, um den Zell-Zell Kontakt zu verlängern und es den adaptiven Immunzellen zu ermöglichen, das Antigen zu erkennen. Diese immunologische Synapse ist darüber hinaus essenziell für die Reaktivierung von Gedächtniszellen. Mehrere Moleküle spielen eine Rolle in diese Synapse, von welchen wir sechs näher untersucht haben: CD2 agiert dabei als Adhäsionsmolekül mit costimulatorischen Eigenschaften. CD11a und CD18 bilden gemeinsam das lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1), eines der wichtigsten Moleküle während der Synapsenbildung. Eines der ersten Adhäsionsmoleküle, dass an der Synapsenbildung beteiligt sein soll, ist hingegen CD50. CD4 und MHC-II sind wichtige Moleküle für die Antigen-Erkennung, und bilden den Kern der immunologischen Synapse. Bei unseren Untersuchungen an mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut von Schweinen wurden naive T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen und myeloide Zellen zunächst phänotypisch mit Hilfe der Durchflusszytometrie charakterisiert, um die Verteilung der oben genannten Moleküle auf den verschiedenen Zelltypen zu beschreiben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CD2 primär auf naiven T-Zellen und Gedächtnis-T-Zellen präsent ist und kaum auf myeloiden Zellen. CD11a und CD18 kann auf den meisten naiven T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen und myeloiden Zellen gefunden werden. CD50 ist auf circa 60 % der myeloiden Zellen vertreten, zu ungefähr 15 % auf Gedächtnis-T-Zellen und zu 9 % auf naiven T-Zellen. Für unser zweites Experiment haben wir Zellen von Schweinen verwendet, die entweder mit einer Ovalbumin Formulierung (OVA) immunisiert wurden oder mit einem Impfstoff (Ingelvac CircoFLEX®, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) gegen das porzine Circovirus 2 (PCV2). Wir versuchten in-vitro antigenspezifische Re-stimulationen durchzuführen, um T-Gedächtniszellen zu aktiveren und Zellteilung anzuregen. Zusätzlich wurden monoklonale Antikörper (mAk) gegen die vorhin erwähnten Moleküle hinzugegeben, um zu untersuchen, ob die Aktivierung der T-Gedächtniszellen reduziert/blockiert werden kann. Mit einem Proliferationsfarbstoff (CellTraceTM Violet solution) konnten wir die Proliferation der Zellen in Antwort auf den hinzugegebenen Stimulus näher untersuchen. Wir haben nachVeränderungen bei der Proliferation von Gedächtniszellen innerhalb der CD4-T-Zellen gesucht, aber auch Veränderungen bei anderen T-Zell-Untergruppen wie zytolytischen T-Zellen und TCRγδ-T-Zellen inspiziert. Veränderungen in der Gedächtniszell-Proliferation waren schwierig zu interpretieren, der Prozentsatz der CD4+ T-Zellen innerhalb aller T-Zellen hat sich aber als guter Indikator eines möglichen Effekts der Antikörper erwiesen. Der anti-CD2 mAk hat die Anzahl an CD4+ T-Zellen deutlich reduziert, genauso wie die Zahl der zytolytischen T-Zellen und der proliferierenden Th-Gedächtniszellen. Dieser Effekt war in beiden Tieren sichtbar, immunisiert mit OVA oder PCV2, aber deutlich stärker in PCV2 Tieren. Der anti-CD4 mAk hat die Zahl der CD4+ T-Zellen sowie der proliferierenden T-Gedächtniszellen reduziert, ohne die Anzahl an zytolytischen T-Zellen zu verringern. Der Anti-MHC-II mAk hat die einzelnen T-Zell-Untergruppen nicht wesentlich beeinflusst, jedoch auch die Zahl der proliferierenden T-Gedächtniszellen in PCV2 Tieren reduziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass neben den Molekülen, die für die Antigenerkennung essenziell sind, vor allem CD2 eine wichtige Rolle in der Reaktivierung von Gedächtniszellen spielt. Die anderen untersuchten Antikörper haben dagegen nur insignifikante Veränderungen in den T-Zell-Untergruppen und in der Reaktivierung von T-Gedächtniszellen hervorgerufen. Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2024 During activation of the adaptive immune system, antigen presenting cells get in contact with T or B cells. They form the immunological synapse, in which antigen recognising molecules, costimulatory molecules and adhesion molecules play an important role. Adhesion molecules close the distance between these two cells, to establish prolonged contact and to achieve antigen recognition by the adaptive immune system. The formation of the immunological synapse is also essential for memory cell reactivation. Several molecules act in this synapse, of which six were investigated more closely in this thesis: CD2 acts as an adhesion molecule with powerful costimulatory properties. CD11a and CD18 form the lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1), one of the most important adhesion molecules during synapse formation. CD50 on the other hand is assumed to be one of the first adhesion molecules involved in synapse assembly. CD4 and MHC-II are important molecules for antigen recognition and therefore form the core of the immunological synapse. During our studies on porcine peripheral blood mononuclear cells, naive T cells, memory T cells and myeloid cells were first phenotypically characterised using flow cytometry, to describe the distribution of the above-mentioned molecules on the different cell types. Our results show, that CD2 can be primarily found on naive and memory T cells and only in very low amounts on myeloid cells. CD11a and CD18 are present on almost all myeloid cells, naïve T cells and memory T cells. CD50 can be found on approximately 60 % of myeloid cells, about 10 % of naïve T cells, and 15 % of memory T cells. For our second experimental setup, cells from pigs that have been immunised with either an ovalbumin formulation (OVA) or porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccine (Ingelvac CircoFLEX®, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) were used. Antigen-specific re-stimulation in in-vitro assays were performed to induce activation and proliferation of memory T cells. In addition, monoclonal antibodies (mAbs) directed against the above-mentioned molecules were added to the setup, to investigate whether activation can be blocked/reduced by interfering with one of these molecules. Using a proliferation dye (CellTraceTM Violet solution), the proliferative response to the stimulus could be assessed. We looked for changes in memory-cell proliferation within CD4 T cells, but also monitored changes in other T-cell subsets like cytolytic T cells and TCRγδ T cells. Even though changes in memory cell proliferation were difficult to interpret, the percentage of CD4+ cells within all T cells proved to be a good indicator of a potential effect of the used antibodies. The anti-CD2 mAb led to a considerable decrease in CD4+ T cells, cytolytic T cells and proliferating Th memory cells. Even though this effect was visible in both, animals immunised with OVA or with PCV2, the effect was more noticeable in PCV2 animals. The anti-CD4 mAb also resulted in a drop in CD4+ T cells and proliferating Th memory cells without decreasing the frequency of cytolytic T cells. Anti-MHC-II mAbs did not seem to influence frequencies of the investigated T cell subsets, but also led to a decrease in Th memory cell proliferation in PCV2 animals. These results suggest, that besides molecules involved in antigen recognition, especially CD2 plays an important role during memory cell reactivation. The other tested antibodies did not seem to obviously effect the reactivation of memory cells and overall T cell populations. http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ https://phaidra.vetmeduni.ac.at/api/object/o:4725/download 10.34876/0kex-wd71 https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:2524 https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:72 application/pdf 956.27 kB 2024