o:264 Production and characterization of a recombinant UCP2 tagged with a new tool for its subcellular visualization en Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2019 Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2019 Uncoupling protein 2 (UCP2) is a member of the mitochondrial uncoupling protein family. It is known to be highly abundant in fast proliferating cells which have an aerobic glycolysis metabolism, such as cancer cells, stem cells and cells of the immune system. UCP2 was shown to transport protons, contributing to the uncoupling of mitochondria and to regulate reactive oxygen species. Recent studies suggest that UCP2 facilitates metabolic adaptability,allowing the cell to survive during specific nutrient deficiencies. However, the absence of specific antibodies suitable for immunohistochemistry hinders further investigation of UCP2’s localization and its function in cells. In order to target UCP2 specifically, a small inert peptide tag was introduced at the N- terminus into the primary sequence of UCP2 and the modified construct was verified by sequencing. Protein expression was then induced in E. Coli following the isolation of protein containing the tag. After proper refolding of the protein into proteoliposomes, the presence of the tag was verified by means of western blot analysis. To check the integrity of the protein after genetic manipulation, electrophysiological measurements were performed, in which proton transport function of the modified protein was tested against a wild-type UCP2. The labeling of UCP2, which does not affect the protein’s integrity and function, serves as a tool that enables the visualization of UCP2 in vivo. This tool ultimately enables the targeting of UCP2 using nanobody - based antibodies, which facilitates super-resolution microscopy in the follow-up studies. Uncoupling Protein 2 (UCP2) ist ein Mitglied der Familie der mitochondrialen Entkopplungsproteine. Es ist bekannt, dass es in schnell proliferierenden Zellen, die einen aeroben Glykolyse-Stoffwechsel haben (wie z. B. Krebszellen, Stammzellen und Zellen des Immunsystems), sehr häufig vorkommt. Es konnte schon gezeigt werden, dass UCP2 Protonen transportiert, zur Entkopplung der Mitochondrien beiträgt und reaktive Sauerstoffspezies reguliert. Jüngste Studien legen nahe, dass UCP2 die metabolische Anpassungsfähigkeit erleichtert und es der Zelle ermöglicht, bei spezifischen Nährstoffmängeln zu überleben. Das Fehlen spezifischer, für die Immunhistochemie geeigneter Antikörper erschwert jedoch die weitere Untersuchung der Lokalisierung von UCP2 und seiner Funktion in Zellen. Um UCP2 spezifisch anzusprechen, wurde ein kleiner inerter Peptid-Tag am N-Terminus in die Primärsequenz von UCP2 eingeführt und das modifizierte Konstrukt durch Sequenzierung verifiziert. Die Proteinexpression wurde dann in E. Coli nach der Isolierung des Proteins, das den Tag enthält, induziert. Nach ordnungsgemäßer Rückfaltung des Proteins in Proteoliposomen wurde die Anwesenheit des Tags mittels Western- Blot-Analyse überprüft. Um die Integrität des Proteins nach der genetischen Manipulation zu überprüfen, wurden elektrophysiologische Messungen durchgeführt, bei denen die Protonentransportfunktion des modifizierten Proteins gegen einen Wildtyp UCP2 getestet wurde. Die Markierung von UCP2, die die Integrität und Funktion des Proteins nicht beeinträchtigt, dient als ein Werkzeug, das die Visualisierung von UCP2 in vivo ermöglicht. Dieses Werkzeug ermöglicht schließlich die gezielte Ansprache von UCP2 mit Hilfe von Nanokörper-basierten Antikörpern, was die superauflösende Mikroskopie in den Folgestudien erleichtert. 1552151 AC15759766 2020-10-06T14:12:25.940Z 44 no 46 Parnia Ardakani 1552167 Elena Pohl 1562799 Florian Grebien 1552167 Felix Locker application/pdf 1536207 https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:264 no yes 1 70 1738 2019 86 Blätter 2019