University of Veterinary Medicine Vienna YB-1 drives aggressive behavior of mesothelioma cells and YB-1 inhibition sensitizes mesothelioma cells to chemotherapy Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020 Background: Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare but aggressive, asbestosrelated tumor which has one of the worst prognoses of all cancers with a 5-year overall survival of 5-10%. Standard of care treatment – a combination of cisplatin and pemetrexed – has remained unchanged for over a decade and new therapeutic options are urgently needed. Strong evidence supports the notion that YB-1 drives resistance to platinum-based chemotherapeutics. Despite this knowledge, there are no studies exploring the effects of inhibition of YB-1 on cisplatin resistance in MPM. Hypothesis and aims: The hypothesis was that YB-1 plays a crucial role in aggressiveness and resistance to chemotherapy in MPM cells. This thesis aimed to assess the impact of overexpression of YB-1 on proliferation, invasion and chemoresistance in MPM cell lines. Furthermore, the effects of siRNA-mediated knockdown of YB-1 and modulation of post translational modifications alone and in combination with cisplatin were explored. Methods: YB-1 overexpression was achieved using a doxycycline-inducible Tet-On system. Effects of overexpression on clonogenicity, invasiveness, proliferation, chemoresistance and tumorigenicity were evaluated via clonogenic survival assays, 3D spheroid sprouting assays, SYBR green-based proliferation assays and a mouse model. Combination effects of cisplatin with YB-1 knockdown via siRNA, inhibition of phosphorylation at serine 102 by BI-D1870 and stabilization of acetylation at lysine 81 by entinostat were investigated via cell viability assays. Combination indices were calculated using compusyn software based on the Chou-Talalay method. Results: We found that YB-1 overexpression stimulated cell scattering and epithelialmesenchymal transition-like morphology changes in all four MPM cell lines. Invasive sprouting through a collagen matrix was significantly increased in the VMC40 cell line. Proliferation and sensitivity to cisplatin did not change when YB-1 was overexpressed. Overexpression of YB-1 also did not induce tumorigenicity in the non-tumorigenic SPC212 cell line. Conversely, silencing YB-1 dramatically reduced cell viability and combination with cisplatin treatment led to synergistic effects. Additionally, both BI-D1870 and entinostat reduced proliferation of MPM cells. Strikingly, we also observed partly synergistic growth-inhibiting effects of BI-D1870 and entinostat in combination with cisplatin. Conclusion: Our data show that YB-1 plays an important role in the aggressive behavior of MPM cells. Targeting YB-1 via siRNA or pharmacologically reduced MPM cell growth. Furthermore, combination with cisplatin showed promising effects. Consequently, we propose YB-1 to be considered as a therapeutic target in MPM. Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020 Hintergrund: Das maligne Pleuramesotheliom (MPM) ist ein seltener, aggressiver und Asbest-assoziierter Tumor mit einer der schlechtesten Prognosen aller Krebsarten – die 5- Jahres-Überlebensrate liegt bei 5-10%. Die Standardmedikation besteht aus einer Kombination von Cisplatin und Pemetrexed und hat sich seit über einem Jahrzehnt nicht geändert. Neue Therapieoptionen werden dringend benötigt. Es gibt starke Hinweise darauf, dass YB-1 die Resistenz gegen platinbasierte Chemotherapeutika antreibt. Trotzdem gibt es noch keine Studien über die Auswirkungen der Hemmung von YB-1 auf die Resistenz gegen Cisplatin bei MPM. Hypothese und Ziele: Die Ausgangshypothese dieser Arbeit ist, dass YB-1 maßgeblich zum aggressiven Verhalten und zur Chemoresistenz im MPM beiträgt. Daher war das Ziel dieser Studie, die Auswirkung von YB-1 Überexpression auf Proliferation, Invasion und Chemoresistenz zu untersuchen. Des Weiteren sollte evaluiert werden, wie sich YB-1 Knockdown und pharmakologische Hemmung auf die Resistenz von MPM Zellen gegen Cisplatin auswirkt. Methoden: Überexpression von YB-1 wurde mit einem Doxycyclin-induzierbaren System erreicht und die Auswirkungen auf Klonogenität, Invasion, Proliferation, Chemoresistenz und Tumorigenität wurden anhand von Überlebensassays, 3D Sphäroidwachstumsassays, Proliferationsassays und einem Mausversuch untersucht. Sowohl YB-1 Knock-down durch siRNA, als auch pharmakologische Hemmung der Phosphorylierung von YB-1 an Serin 102 durch BI-D1870 und Hemmung der Deacetylierung an Lysin 81 durch Entinostat wurden mit Cisplatin kombiniert und mittels Zellwachstumstests untersucht. Die Kombinationsindizes (KIs) wurden mit dem Compusyn Programm basierend auf der Chou-Talaly Methode berechnet. Resultate: YB-1 Überexpression stimulierte die Streuung der Zellen und diese nahmen Morphologien an, die epithelial-mesenchymal Übergängen ähneln. Invasion durch eine Kollagenmatrix war in der Zelllinie VMC40 signifikant erhöht. Andererseits hatte die Überexpression keine Auswirkungen auf Chemoresistenz und Proliferation der untersuchten MPM Zellen und konnte in der nicht-tumorigenen Linie SPC212 kein Tumorwachstum in Mäusen induzieren. YB-1 Knock-down durch siRNA reduzierte das Zellwachstum drastisch und führte zu einer verstärkten Wirkung in Kombination mit Cisplatin. Des Weiteren reduzierten sowohl BI-D1870, als auch Entinostat das Wachstum unserer MPM Zellen als Monotherapie. Bemerkenswerterweise führten beide Inhibitoren in Kombination mit Cisplatin zu einer verstärkten Wirkung. Fazit: Unsere Daten zeigen, dass YB-1 eine wichtige Rolle in der Aggressivität von MPM Zellen spielt. In Anbetracht der Tatsache, dass sowohl das Silencing von YB-1, als auch die Hemmung posttranlationaler Modifikatoren von YB-1 das Zellwachstum verringerten und in Kombination mit Cisplatin sogar zu einer verstärkten Wirkung führten, erscheint es sinnvoll, YB-1 als potenzielles neues Therapietarget im MPM in Erwägung zu ziehen. en TEXT master's Dissertation 2020 2020 Emminger, Dominik Grebien, Florian