o:1524 Identifying modulators of TNFα mediated cytotoxicity using genome-wide CRISPR screens en Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020 Besides interferon-γ, tumor necrosis factor-α is one of the key cytokines mediating cytotoxic activity and anti-tumor immunity. However, in certain cancers types resistance to tumor necrosis factor-α mediated killing mechanism were observed that result in rapid cancer progression. Strategies to make cells more sensitive to tumor necrosis factor-α mediated cytotoxicity hold great promise for cancer treatment. On the molecular level, both, sensitization and resistance to tumor necrosis factor-α are incompletely understood. In recent years, CRISPR/Cas9 loss-of-function screens have proven to be a powerful tool to study biological processes on a genome wide level. The aim is to adapt this technology to identify genetic dependencies that render a human cancer cell line resistant or more sensitive to tumor necrosis factor-α treatment. For this purpose, the colon carcinoma cell line RKO which is sensitive to tumor necrosis factor-α treatment was utilized. This cell line was adapted for CRISPR screening in the Zuber lab by (i) engineering an inducible Cas9 allele and (ii) infecting with a whole-genome sgRNA library. This enables the induction of Cas9 expression at the starting point of the screen, resulting in gene editing and generation of knockout cells. The comparison of towards tumor necrosis factor-α condition towards the untreated control, enables the identification of genetic dependencies. This knowledge will improve the understanding of the basic mechanisms of resistance and sensitization to tumor necrosis factor -α mediated cytotoxicity and could be exploited to improve cancer immunotherapy strategies. In addition, a human co-culture system to test killing efficacy of gene-edited tumor cell lines via cytotoxic CD8+ T cells was established and could be used for future validation of these identified genetic dependencies. Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020 Neben Interferon-γ ist der Tumornekrosefaktor-α eines der wichtigsten Zytokine, welches auch in der Tumorbekämpfung eine große Rolle spielt. Bei bestimmten Tumoren wurde jedoch eine Resistenz gegen die zytotoxische Aktivität des Tumornekrosefaktor-α beobachtet. Strategien, welche solche Resistenzen aufheben, sind vielversprechend für die Tumortherapie. Auf molekularer Ebene sind Mechanismen, welche zur Sensibilisierung oder Resistenz gegen die cytotoxische Aktivität des Tumornekrosefaktor-α führen bislang weitestgehend unerforscht. In den letzten Jahren haben sich CRISPR/Cas9 Loss-of-Function Screens als eine vielversprechende Technologie zur Untersuchung biologischer Prozesse auf Genomebene erwiesen. Ziel ist es mithilfe dieser Technologie genetische Abhängigkeiten zu identifizieren, welche eine menschliche Tumorzelllinie resistent oder sensitiver für der Behandlung mit Tumornekrosefaktor-α machen. Dafür wird eine Darmkrebs-Zelllinie, welche sensitiv zur zytotoxischen Aktivität des Tumornekrosefaktor-α ist, verwendet. Diese Zelllinie wurde im Zuber-Labor für das CRISPR/Cas9-Screening adaptiert, indem sie (i) ein induzierbares Cas9-Konstrukt exprimiert und (2) mit einer sgRNA library infiziert wurde. Dies ermöglicht die Induktion der Cas9 Expression zu Beginn des Screens, was eine Gen-Edition und somit die Entstehung von knockout-Zellen zur Folge hat. Der Vergleich der Tumornekrosefaktor-α behandelten Zellkultur zur unbehandelten Kontrolle ermöglicht es genetische Abhängigkeiten zu identifizieren. Ein besseres Verständnis dieser ermöglicht neue Einblicke in die grundlegenden Mechanismen der Tumorresistenz gegenüber cytotoxischer Aktivität und könnte entscheidend zur Verbesserung der Tumor-Immuntherapien beitragen. Des weiteren wurde ein humanes Co-Kultur System entwichet, welches die zytotoxische Aktivität von CD8+ T-Zellen gegenüber genveränderten Tumorzellen modelliert. Dieses System kann auch zur Validierung der identifizierten Mechanismen, welche zur Sensibilisierung oder Resistenz gegen die cytotoxische Aktivität des Tumornekrosefaktor-α führen, verwendet werden. 1552151 AC15728411 2023-04-20T07:40:42.701Z 44 no 46 Stefanie Ruhland 1552167 Veronika Sexl application/pdf 2361371 https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:1524 no yes 1 70 1739 110 Blätter 2020