Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2021

Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021

Parasitic protozoa of the genus Leishmania cause the disease leishmaniasis. Leishmania live as extracellular promastigotes in the sandfly vector and as intracellular amastigotes in macrophages of the host. These two forms survive under different conditions, such as pH values, temperatures, different availability of energy sources (glucose, amino acids, fatty acids). As Leishmania possess a glycosome and a single mitochondrion, they are hypothesized to gain energy via glycolytic lactate-derived as well as oxidative mitochondrial pathways. Depending on the metabolic situation the proportion of these pathways is supposed to change. In this bachelor thesis, non-human-pathogenic Leishmania tarentolae promastigotes (LtP) were studied. Their oxidative mitochondrial function was analysed using OxoPlates® with integrated fluorescence O2 sensors and a fluorescence plate reader. Extracellular acidification rates (ECAR) were determined using HydroPlates® with integrated fluorescence pH indicators. The aim of this study was to investigate the contribution of glycolysis in leishmanial energy production by measuring ECAR. Results have shown that the complex I inhibitor rotenone (up to 800 μM) has no influence on mitochondrial O2 consumption and ECAR of Leishmania, while complex III inhibitors antimycin A (≥ 10 nM) and myxothiazol (≥ 10 μM) significantly decreased O2 consumption. Surprisingly, ECAR were not stimulated in their presence, but even decreased. While in the absence of glucose O2 consumption of LtP decreased only by around 60 %, their ECAR were completely inhibited. Moreover, 2-deoxy-D-glucose (inhibitor of glycolysis; 25 mM) did not influence O2 consumption of glucose-supplemented (5 mM) LtP, while decreasing leishmanial ECAR by 57 %. The ATP synthase inhibitor oligomycin (5 μM) inhibited glucose-dependent O2 consumption by 42 %, while ECAR were only moderately enhanced. However, considering the contribution of mitochondrial CO2-derived ECAR in total ECAR, we could demonstrate that the proportion of glycolytic to oxidative mitochondrial pathways is shifted to a higher glycolytic state in comparison to control LtP (52.9 % vs. 11.8 %).

Parasitische Protozoen der Gattung Leishmania verursachen die Krankheit Leishmaniose. Leishmanien leben als extrazelluläre Promastigoten in Sandfliegen als Vektor und als intrazelluläre Amastigoten in den Makrophagen des Wirts. Diese zwei Lebensformen überleben bei unterschiedlichen Bedingungen, wie pH, Temperatur, verschiedenen Energiequellen (Glukose, Aminosäuren, Fettsäuren). Da Leishmanien ein Glykosom und ein einzelnes Mitochondrium besitzen, wird angenommen, dass sie ihre Energie sowohl durch glykolytische Laktat-abhängige als auch durch oxidative mitochondriale Stoffwechselwege gewinnen. In Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation kann sich das Verhältnis dieser Stoffwechselwege ändern. In dieser Bachelorarbeit wurden für den Menschen nicht pathogene Leishmania tarentolae Promastigoten (LtP) untersucht. Deren oxidative mitochondriale Funktion wurde mittels OxoPlates® mit integrierten fluoreszierenden O2-Sensoren und einem Fluoreszenz- Plattenlesegerät analysiert. Die extrazellulären Versauerungsraten (ECAR) wurden mittels HydroPlates® mit integrierten fluoreszierenden pH-Indikatoren bestimmt. Das Ziel dieser Untersuchungen war es, die Beteiligung der Glykolyse an der Energieproduktion von Leishmanien mittels ECAR zu untersuchen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass der Komplex I Inhibitor Rotenon (bis zu 800 μM) keinen Einfluss auf den mitochondrialen O2-Verbrauch und die ECAR von Leishmanien hat, während die Komplex III Inhibitoren Antimycin A (≥ 10 nM) und Myxothiazol (≥ 10 μM) den O2-Verbrauch signifikant reduziert haben. Überraschenderweise wurden die ECAR in deren Anwesenheit nicht stimuliert, sondern nahmen sogar ab. Während der O2-Verbrauch der LtP in Abwesenheit von Glukose nur um rund 60 % gesenkt wurde, wurden die ECAR vollständig inhibiert. Außerdem zeigte 2-Desoxy-D-glukose (Inhibitor der Glykolyse; 25 mM) keinen Einfluss auf den O2-Verbrauch von Glukose-angereicherten (5 mM) LtP, während die ECAR von Leishmanien um 57 % gesenkt wurden. Der ATP Synthase Inhibitor Oligomycin (5 μM) hemmte den Glukose-abhängigen O2-Verbrauch um 42 %, während die ECAR nur moderat erhöht wurden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass sich das Verhältnis des glykolytischen zum oxidativen mitochondrialen Stoffwechselweg in Richtung eines höheren glykolytischen Status im Vergleich zu Kontroll-LtP verschiebt (52,9 % vs. 11,8 %), wenn man den Anteil der mitochondrialen CO2-abhängigen ECAR an der totalen ECAR berücksichtigt.

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IV, 44 Blätter